抗體偶聯(lián)藥物發(fā)揮作用的步驟和機制
Antibody-drug Conjugate (ADC)是一類結(jié)合了化學療法和免疫療法的高效藥物。這個概念最早于 100 多年前由德國科學家/醫(yī)生 Paul Ehrlich 提出。ADC 由抗體 (Antibody)、細胞毒素分子 (ADC Cytotoxin, payload) 以及連接兩者的連接子 (Linker) 組成。Paul Ehrlich 將 ADC 比喻成“魔法子彈”，因為它能在不傷害有機體 (毒副作用小) 的情況下特異性識別目標 (癌細胞)。ADC 毒素分子通過破壞 DNA、微管蛋白等從而阻止腫瘤細胞分裂，起到殺死細胞的作用。ADC 的精準靶向，徹底消除，簡直媲美“狙擊手”。
一個成功的 ADC 分子，首先要保留單克隆抗體的選擇性，同時能夠釋放足夠高濃度的 payload，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。我們先看下 ADC 發(fā)揮作用的步驟和機制。
綜上，在一個成功的 ADC 分子中，抗體的特異性、linker 的穩(wěn)定性以及 payload 的高活性缺一不可。
■ ADC 的各組分是如何組裝成完整“魔法子彈”的呢？
抗體的連接位置集中在 IgG1 和 IgG4 家族。最早發(fā)展起來的方法之一是位于 linker-payload 末端的親電子基團 (比如馬來酰亞胺或 N-hydroxysuccinimide (NHS) 片段)，與抗體暴露的賴氨酸殘基組裝在一起。這種“隨機”偶聯(lián)方法會得到 ADC 的異質(zhì)混合物。這樣的混合物會對藥代動力學、耐受性和療效等產(chǎn)生負面影響。直到后來開發(fā)出的位點特異性偶聯(lián)方法，大大減少了異質(zhì)性。
藥物抗體比 (Drug-to-antibody ratio, DAR) 是抗體偶聯(lián)藥物的平均數(shù)量，是 ADC 的一個重要屬性。目前的偶聯(lián)化學方法是賴氨酸側(cè)鏈酰胺化或半胱氨酸鏈間二硫鍵還原，通常每個抗體的藥物負載為 0~8 個藥物 (D0~D8)。
通過賴氨酸殘基結(jié)合：雖然賴氨酸殘基是有效的親核基團，但是因為在整個抗體結(jié)構(gòu)中分布著 80~100 個賴氨酸殘基。所以作為最早開發(fā)的偶聯(lián)方法，其選擇性低。
通過硫醇基團偶聯(lián)：一般來說，抗體不含游離硫醇，目前最常用的是人類 IgG1 抗體，有 4 個鏈間二硫鍵和 12 個鏈內(nèi)二硫鍵，傳統(tǒng)方法需要用 TCEP、DTT 或者 2-MEA 還原劑將 4 個鏈間二硫鍵氧還原打開，產(chǎn)生游離的硫醇，與 linker-payload 復合體中的親電基團發(fā)生反應 (馬來酰亞胺、NHS)，產(chǎn)生不同 DAR 數(shù)和不同連接位點的 ADC 偶聯(lián)異質(zhì)混合物。
位點特異性偶聯(lián) (硫醇基團的特異性偶聯(lián))：最著名的技術要數(shù) Genentech 的 THIOMABTM 技術了。THIOMABs 利用基因工程技術在抗體特定位置插入帶有半胱氨酸殘基 (游離硫醇)。半胱氨酸殘基與 payload 偶聯(lián)，這種定點偶聯(lián)方式，得到的 ADC 的 DAR 為 2。在體內(nèi)實驗顯示出優(yōu)越的安全性。
點擊化學偶聯(lián)：這種方法常常使用含疊氮化物的 linker，將疊氮化物基團連接到 payload 結(jié)構(gòu)的末端。疊氮化物可以與加入抗體的 DBCO 基團反應。其優(yōu)點是反應非常高效和高產(chǎn)，條件溫和。
其它偶聯(lián)形式：除了上述以外，還有其它基于醇 (例如可以形成碳酸鹽、醚和酯化合物) 和醛的偶聯(lián)技術 (通過甲酰甘氨酸生成酶 (FGE) 偶聯(lián))，通過工程氨基酰基——tRNA (aaRS)、氧化唾液酶和轉(zhuǎn)氨試劑的偶聯(lián)技術實現(xiàn)。
■ 那么如何檢測 ADC 的“好與壞”呢？
藥物抗體比 (DAR)：目前已經(jīng)發(fā)展了很多測定 DAR 的方案，包括全抗體質(zhì)譜法、分光光度計測試法和各種色譜方法 (包括但不限于 HPLC、UV/VIS 紫外/可見光光譜分析)。
ADC 中未結(jié)合毒素的測定：反相 (RP)-HPLC 可用于根據(jù)外部標準曲線定量未綴合的有效載荷連接器的含量。
疏水性預測：在新 ADC 的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段，為了降低 ADC 的疏水性，盡可能降低有效毒素分子和連接子的分子量是至關重要的。在環(huán)結(jié)構(gòu)和鏈中盡可能多的雜原子，以及盡可能多的親水官能團作為取代基 (如-NH2、-OH/-COOH) 有助于優(yōu)化親水性。
ADC 的體外效價隨著 DAR 的增加而增加，但是 ADC 的血漿清除率也隨著 DAR 的增加而增加，從而減少了藥物暴露和體內(nèi)生物效果。親水性改善后的 ADC 明顯具有優(yōu)越的體內(nèi)活性。親水性改善后的ADC，血漿清除率降低，體內(nèi)活性明顯改善。
■ ADC 發(fā)展中的挑戰(zhàn)和機遇
連接的不穩(wěn)定性：這種不穩(wěn)定性可導致 payload 過早釋放到血液中，并導致 ADC 的非特異性攝取和脫靶毒性。第一代的 ADC 具有酸可降解鍵 (如腙)，其在偏中性 pH 的血漿中保持穩(wěn)定，內(nèi)化后在較低 pH 值的溶酶體中釋放。但這種 linker (尤其是基于多肽的 linker) 會對血清蛋白酶敏感以及自發(fā)解偶聯(lián)現(xiàn)象導致其在血漿中不穩(wěn)定。和可降解 linker (SPP-DM1 和 VcMMAE) 相比，不可降解的 linker (mcc-DM1 和 mcMMAF) 具有更低的肝臟和血液毒性。因為其 payload 釋放少，細胞毒性減小。但是不可降解 linker 不適用于所有靶點，畢竟需要單抗完全分解代謝才能釋放 payload，另一方面，可降解 linker 導致 payload 的過早釋放也可能通過“旁觀者效應”發(fā)揮更好的療效 (旁觀者效應：活躍的 payload 也可能殺死周圍的腫瘤細胞)。
非特異性內(nèi)吞作用：一般來說，IgG 抗體的凈正電荷增加導致血漿清除率增加，組織分布增加。因此，優(yōu)化 ADC 表面電荷，減少正常細胞中非靶向攝取，同時保留靶點腫瘤細胞攝取，有利于改善治療指標 (TI)。疏水性會促進 ADC、尤其是高 DAR 的 ADC 的聚集和非特異性內(nèi)吞，從而產(chǎn)生脫靶效應。高 DAR 的 ADC 本身也會被其它具有非特異性、內(nèi)吞能力強的細胞清除，因此優(yōu)化 DAR 也是改善 TI 的重要策略。
受體介導的攝取機制：FcγRs 介導的 ADC 脫靶毒性主要體現(xiàn)在血液毒性。血液毒性是含有 Auristatin (MAME, MMAF)、Calicheamicin 和 Maytansinoid (DM-1) 的 ADC 最常見的脫靶劑量限制毒性 dose-limiting toxicities (DLTs)。
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參考文獻
1. Puregmaa Khongorzul, Juan Zhang, et al. Antibody-Drug Conjugates: A Comprehensive Review. Mol Cancer Res. 2020 Jan;18(1):3-19.
2. Ilona Pysz, Paul J. M. Jackson, David E. Thurston. Introduction to Antibody–Drug Conjugates (ADCs). Royal Society of Chemistry. 2019, pp. 1-30. Chapter 1.
3. Christina Peters, Stuart Brown. Antibody-drug conjugates as novel anti-cancer chemotherapeutics. Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225.
4. Xiuxia Sun, John M. Lambert, et al. Effects of Drug-Antibody Ratio on Pharmacokinetics, Biodistribution, Efficacy, and Tolerability of Antibody-Maytansinoid Conjugates. Bioconjug Chem. 2017 May 17;28(5):1371-1381.
5. Aurijit Sarkar, Glen E. Kellogg. Hydrophobicity--shake flasks, protein folding and drug discovery. Curr Top Med Chem. 2010;10(1):67-83.
6. Robert P Lyon, Peter D Senter, et al. Reducing hydrophobicity of homogeneous antibody-drug conjugates improves pharmacokinetics and therapeutic index. Nat Biotechnol. 2015 Jul;33(7):733-5.
7. Prathap Kumar Mahalingaiah, et al. Potential mechanisms of target-independent uptake and toxicity of antibody-drug conjugates. Pharmacol Ther. 2019 Aug;200:110-125
一個成功的 ADC 分子，首先要保留單克隆抗體的選擇性，同時能夠釋放足夠高濃度的 payload，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。我們先看下 ADC 發(fā)揮作用的步驟和機制。
圖 1. ADC 發(fā)揮作用的機制
綜上，在一個成功的 ADC 分子中，抗體的特異性、linker 的穩(wěn)定性以及 payload 的高活性缺一不可。
■ ADC 的各組分是如何組裝成完整“魔法子彈”的呢？
抗體的連接位置集中在 IgG1 和 IgG4 家族。最早發(fā)展起來的方法之一是位于 linker-payload 末端的親電子基團 (比如馬來酰亞胺或 N-hydroxysuccinimide (NHS) 片段)，與抗體暴露的賴氨酸殘基組裝在一起。這種“隨機”偶聯(lián)方法會得到 ADC 的異質(zhì)混合物。這樣的混合物會對藥代動力學、耐受性和療效等產(chǎn)生負面影響。直到后來開發(fā)出的位點特異性偶聯(lián)方法，大大減少了異質(zhì)性。
藥物抗體比 (Drug-to-antibody ratio, DAR) 是抗體偶聯(lián)藥物的平均數(shù)量，是 ADC 的一個重要屬性。目前的偶聯(lián)化學方法是賴氨酸側(cè)鏈酰胺化或半胱氨酸鏈間二硫鍵還原，通常每個抗體的藥物負載為 0~8 個藥物 (D0~D8)。
通過賴氨酸殘基結(jié)合：雖然賴氨酸殘基是有效的親核基團，但是因為在整個抗體結(jié)構(gòu)中分布著 80~100 個賴氨酸殘基。所以作為最早開發(fā)的偶聯(lián)方法，其選擇性低。
圖 2. 賴氨酸殘基結(jié)合的偶聯(lián)過程
通過硫醇基團偶聯(lián)：一般來說，抗體不含游離硫醇，目前最常用的是人類 IgG1 抗體，有 4 個鏈間二硫鍵和 12 個鏈內(nèi)二硫鍵，傳統(tǒng)方法需要用 TCEP、DTT 或者 2-MEA 還原劑將 4 個鏈間二硫鍵氧還原打開，產(chǎn)生游離的硫醇，與 linker-payload 復合體中的親電基團發(fā)生反應 (馬來酰亞胺、NHS)，產(chǎn)生不同 DAR 數(shù)和不同連接位點的 ADC 偶聯(lián)異質(zhì)混合物。
圖 3. 硫醇基團偶聯(lián)過程
位點特異性偶聯(lián) (硫醇基團的特異性偶聯(lián))：最著名的技術要數(shù) Genentech 的 THIOMABTM 技術了。THIOMABs 利用基因工程技術在抗體特定位置插入帶有半胱氨酸殘基 (游離硫醇)。半胱氨酸殘基與 payload 偶聯(lián)，這種定點偶聯(lián)方式，得到的 ADC 的 DAR 為 2。在體內(nèi)實驗顯示出優(yōu)越的安全性。
圖 4. 位點特異性偶聯(lián)過程
點擊化學偶聯(lián)：這種方法常常使用含疊氮化物的 linker，將疊氮化物基團連接到 payload 結(jié)構(gòu)的末端。疊氮化物可以與加入抗體的 DBCO 基團反應。其優(yōu)點是反應非常高效和高產(chǎn)，條件溫和。
圖 5. 點擊化學偶聯(lián)過程
其它偶聯(lián)形式：除了上述以外，還有其它基于醇 (例如可以形成碳酸鹽、醚和酯化合物) 和醛的偶聯(lián)技術 (通過甲酰甘氨酸生成酶 (FGE) 偶聯(lián))，通過工程氨基酰基——tRNA (aaRS)、氧化唾液酶和轉(zhuǎn)氨試劑的偶聯(lián)技術實現(xiàn)。
■ 那么如何檢測 ADC 的“好與壞”呢？
藥物抗體比 (DAR)：目前已經(jīng)發(fā)展了很多測定 DAR 的方案，包括全抗體質(zhì)譜法、分光光度計測試法和各種色譜方法 (包括但不限于 HPLC、UV/VIS 紫外/可見光光譜分析)。
ADC 中未結(jié)合毒素的測定：反相 (RP)-HPLC 可用于根據(jù)外部標準曲線定量未綴合的有效載荷連接器的含量。
疏水性預測：在新 ADC 的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段，為了降低 ADC 的疏水性，盡可能降低有效毒素分子和連接子的分子量是至關重要的。在環(huán)結(jié)構(gòu)和鏈中盡可能多的雜原子，以及盡可能多的親水官能團作為取代基 (如-NH2、-OH/-COOH) 有助于優(yōu)化親水性。
ADC 的體外效價隨著 DAR 的增加而增加，但是 ADC 的血漿清除率也隨著 DAR 的增加而增加，從而減少了藥物暴露和體內(nèi)生物效果。親水性改善后的 ADC 明顯具有優(yōu)越的體內(nèi)活性。親水性改善后的ADC，血漿清除率降低，體內(nèi)活性明顯改善。
■ ADC 發(fā)展中的挑戰(zhàn)和機遇
連接的不穩(wěn)定性：這種不穩(wěn)定性可導致 payload 過早釋放到血液中，并導致 ADC 的非特異性攝取和脫靶毒性。第一代的 ADC 具有酸可降解鍵 (如腙)，其在偏中性 pH 的血漿中保持穩(wěn)定，內(nèi)化后在較低 pH 值的溶酶體中釋放。但這種 linker (尤其是基于多肽的 linker) 會對血清蛋白酶敏感以及自發(fā)解偶聯(lián)現(xiàn)象導致其在血漿中不穩(wěn)定。和可降解 linker (SPP-DM1 和 VcMMAE) 相比，不可降解的 linker (mcc-DM1 和 mcMMAF) 具有更低的肝臟和血液毒性。因為其 payload 釋放少，細胞毒性減小。但是不可降解 linker 不適用于所有靶點，畢竟需要單抗完全分解代謝才能釋放 payload，另一方面，可降解 linker 導致 payload 的過早釋放也可能通過“旁觀者效應”發(fā)揮更好的療效 (旁觀者效應：活躍的 payload 也可能殺死周圍的腫瘤細胞)。
非特異性內(nèi)吞作用：一般來說，IgG 抗體的凈正電荷增加導致血漿清除率增加，組織分布增加。因此，優(yōu)化 ADC 表面電荷，減少正常細胞中非靶向攝取，同時保留靶點腫瘤細胞攝取，有利于改善治療指標 (TI)。疏水性會促進 ADC、尤其是高 DAR 的 ADC 的聚集和非特異性內(nèi)吞，從而產(chǎn)生脫靶效應。高 DAR 的 ADC 本身也會被其它具有非特異性、內(nèi)吞能力強的細胞清除，因此優(yōu)化 DAR 也是改善 TI 的重要策略。
受體介導的攝取機制：FcγRs 介導的 ADC 脫靶毒性主要體現(xiàn)在血液毒性。血液毒性是含有 Auristatin (MAME, MMAF)、Calicheamicin 和 Maytansinoid (DM-1) 的 ADC 最常見的脫靶劑量限制毒性 dose-limiting toxicities (DLTs)。
| ADC |
| Trastuzumab emtansine 是一種抗體偶聯(lián)藥物 (ADC)，其結(jié)合了 HER2 靶向的曲妥珠單抗的抗腫瘤特性以及微管抑制劑 DM1 的細胞毒活性�？捎糜谕砥谌橄侔┑难芯�。 |
| Trastuzumab deruxtecan 是一種抗人表皮生長因子受體 2 (HER2) 抗體-藥物偶聯(lián)物 (ADC)。由人源化抗 HER2 抗體，酶促裂解的肽接頭和拓撲異構(gòu)酶 I 抑制劑組成�？捎糜� HER2 陽性乳腺癌和胃癌的研究。 |
| ADC linker & Drug-Linker Conjugates for ADC |
| MC-Val-Cit-PAB 是一種可降解 (cleavable) 的 ADC linker，可用于合成抗體偶聯(lián)藥物 (ADC)。 |
| MC-Val-Cit-PAB-duocarmycin 是由 DNA 小溝結(jié)合烷化劑 duocarmycin 和 ADC linker MC-Val-Cit-PAB 連接而成，可用來制備抗體偶聯(lián)藥物。 |
| SMCC 是一種蛋白質(zhì)交聯(lián)劑。SMCC 接合抗原耦合脾臟細胞來誘導抗原特異性免疫反應。 |
| SMCC-DM1 是由微管破壞劑 DM1 和 ADC linker SMCC 連接而成，可用來制備抗體偶聯(lián)藥物。 |
| ADC Cytotoxin |
| Doxorubicin hydrochloride 一種具有細胞毒性的蒽環(huán)類抗生素，是一種抗癌化療試劑。是一種有效的人類 DNA topoisomerase I 和 topoisomerase II 抑制劑，IC50 分別為 0.8 μM 和 2.67 μM�？山档� AMPK 及其下游靶蛋白乙酰輔酶 A 羧化酶的磷酸化。還可誘導凋亡 (apoptosis) 和自噬。 |
| Methotrexate 一種抗代謝 (antimetabolite) 和抗葉酸劑 (antifolate)，可抑制二氫葉酸還原酶，從而防止葉酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸并抑制 DNA 合成。也是一種免疫抑制劑和抗腫瘤劑，用于類風濕關節(jié)炎和研究多種癌癥 (如急性淋巴細胞白血病)。 |
| Camptothecin 是有效的 DNA 拓撲異構(gòu)酶 I 抑制劑，IC50 值為 679 nM。 |
| MMAF hydrochloride 是一種有效的微管蛋白聚合 (tubulin polymerization) 抑制劑，用作抗腫瘤藥物。廣泛用作抗體偶聯(lián)藥物 (ADCs) 的細胞毒性成分，如 Vorsetuzumab mafodotin 和 SGN-CD19A。 |
| Duocarmycin TM 是一種非常有效的有抗腫瘤活性的抗生素。是一種 DNA 烷化劑。 |
參考文獻
1. Puregmaa Khongorzul, Juan Zhang, et al. Antibody-Drug Conjugates: A Comprehensive Review. Mol Cancer Res. 2020 Jan;18(1):3-19.
2. Ilona Pysz, Paul J. M. Jackson, David E. Thurston. Introduction to Antibody–Drug Conjugates (ADCs). Royal Society of Chemistry. 2019, pp. 1-30. Chapter 1.
3. Christina Peters, Stuart Brown. Antibody-drug conjugates as novel anti-cancer chemotherapeutics. Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225.
4. Xiuxia Sun, John M. Lambert, et al. Effects of Drug-Antibody Ratio on Pharmacokinetics, Biodistribution, Efficacy, and Tolerability of Antibody-Maytansinoid Conjugates. Bioconjug Chem. 2017 May 17;28(5):1371-1381.
5. Aurijit Sarkar, Glen E. Kellogg. Hydrophobicity--shake flasks, protein folding and drug discovery. Curr Top Med Chem. 2010;10(1):67-83.
6. Robert P Lyon, Peter D Senter, et al. Reducing hydrophobicity of homogeneous antibody-drug conjugates improves pharmacokinetics and therapeutic index. Nat Biotechnol. 2015 Jul;33(7):733-5.
7. Prathap Kumar Mahalingaiah, et al. Potential mechanisms of target-independent uptake and toxicity of antibody-drug conjugates. Pharmacol Ther. 2019 Aug;200:110-125
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