小分子降解劑分子膠的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1358　發(fā)布日期：2021-8-30　來(lái)源：MedChemExpress

小分子抑制劑是靶向治療的主要類型之一，但也有它的局限性，如無(wú)法完全阻斷蛋白功能，會(huì)引起的脫靶效應(yīng)和副作用等。然而近年來(lái)，小分子降解劑顛覆了先前認(rèn)為 “不可治療” 靶點(diǎn)的觀點(diǎn)。這些小分子降解劑不僅選擇性高，用量小，而且大大降低脫靶效應(yīng)。

什么是分子膠？

小分子降解劑通過(guò)介導(dǎo)泛素化連接酶與靶蛋白的識(shí)別，對(duì)靶蛋白進(jìn)行降解。目前蛋白降解劑主要有兩類，一類是雙功能分子降解劑，通常稱為 PROTAC (蛋白水解靶向嵌合體)，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白。另一類是 “分子膠” (Molecular glues)，也是通過(guò)結(jié)合泛素化連接酶，但與 PROTAC 不同的是，分子膠是通過(guò)修飾泛素化連接酶表面，從而識(shí)別并降解全新底物 (Neo-substrate)。例如磺胺類抗腫瘤藥 (Indisulam); 和免疫調(diào)節(jié)藥物 (IMiDs) 沙利度胺 (Thalidomide)、來(lái)那度胺 (Lenalidomide)。

A. “分子膠” 作用原理 B. 來(lái)那度胺 (Lenalidomide) 的作用機(jī)制
理論來(lái)說(shuō)，PROTAC 分子既可以作為 PROTAC 降解劑來(lái)結(jié)合和降解靶蛋白，也可以充當(dāng) “分子膠” 降解新底物。最近就發(fā)現(xiàn)一類鄰苯二甲酰亞胺共軛的 PROTAC 降解劑其實(shí)是以分子膠的方式起作用，例如 MG-277。另外，最近 Benjamin Cravatt 團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種新型的“分子膠”。這類“分子膠”是以共價(jià)修飾 E3 連接酶 DCAF16 的方式，特異性促進(jìn)核蛋白降解。
PROTAC “變身” 分子膠
MG-277 是對(duì) MD-222 (PROTAC MDM2 降解劑) 進(jìn)行了簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)修飾而來(lái)的。但正是這一小步的修飾，卻帶來(lái)了完全不同的靶向降解 “結(jié)局”。

MG-277: MD-222 抑制劑部分的 MI-1061 的苯甲酸被甲基取代
首先，不同于 MD-222 對(duì)野生型 p53 (人白細(xì)胞 RS4;11) 的選擇性，MG-277 對(duì)攜帶野生型，突變 p53 (RS4;11/IRMI-2 細(xì)胞) 或缺失 p53 的癌細(xì)胞系都有抑制作用，而且在誘導(dǎo) MDM2 降解方面要比 MD-222 要低得多，且不能激活野生型 p53。通過(guò)敲除 MDM2 等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MG-277 的對(duì)細(xì)胞的抑制作用不僅不依賴 MDM2，本身也不與 MDM2 結(jié)合。
MG-277 對(duì)細(xì)胞的抑制活性，到底從何而來(lái)？
通過(guò)對(duì) MG-277 中的戊二酰亞胺的氨基 (與 cereblon 結(jié)合相關(guān)) 甲基化，即合成了 MC-024，發(fā)現(xiàn) MC-024 在抑制細(xì)胞 (RS4;11，RS4;11/IRMI-2，MDA-MB-231 和 MDA-MB-468) 生長(zhǎng)方面的效率要低得多。在來(lái)那度胺與 MG-277 競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，來(lái)那度胺降低了 MG-277 對(duì)上述細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制。因此，MG-277 對(duì)野生型和突變型 p53 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，需要與 cereblon 結(jié)合。據(jù)此，作者推測(cè)，MG-277 實(shí)際上可能起的分子膠的作用，通過(guò)促進(jìn)某些細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 -E3 連接酶 (CRL4^CRBN) 復(fù)合物募集，進(jìn)行泛素化和隨后的蛋白酶體降解。

如果 MG-277 作為分子膠，真正的靶標(biāo)蛋白是什么？
通過(guò)對(duì)野生型 p53 細(xì)胞和攜帶突變的 p53 細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析，MG-277 的靶標(biāo)蛋白為 GSPT1，且降解 GSPT1 的水平取決于其與 cereblon，蛋白酶體和 Cullin-RING E3 連接酶功能的結(jié)合。MG-277 捕獲了一些與相互作用有關(guān)的關(guān)鍵殘基 (cereblon 中 Phe150 和 Glu377)，這些殘基對(duì)于將 GSPT1 募集到 cereblon 中是至關(guān)重要的。
總而言之，MG-277 以不依賴 p53 和 MDM2，但以依賴 cereblon，CUL4 E3 泛素連接酶和蛋白酶體的方式，在癌細(xì)胞中快速誘導(dǎo) GSPT1 降解。MG-277 誘導(dǎo) GSPT1 降解是其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性的原因。
而設(shè)計(jì)的鄰苯二甲酰亞胺共軛降解物，既可以作為目的蛋白質(zhì)的真正降解劑，也可以作為將新底物蛋白募集到 CRL4^CRBN 的分子膠，用于泛素化和隨后的降解。因此，在 PROTAC 降解劑的設(shè)計(jì)中需要考慮這兩種機(jī)制。

特異性降解 “核蛋白” 的分子膠

接著，我們來(lái)講講另外一種新型“分子膠”。Benjamin Cravatt 團(tuán)隊(duì)找到了新的 E3 連接酶成員 DCAF16，一種目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)相關(guān)功能的多肽 (在哺乳動(dòng)物中高度保守，但嚙齒動(dòng)物卻不存在的多肽)，此類 “分子膠” 以共價(jià)修飾 DCAF16 的方式，特異性促進(jìn)核蛋白降解。
DCAF16 連接酶的發(fā)現(xiàn)

Benjamin Cravatt 團(tuán)隊(duì)在之前的工作中鑒定出一些與半胱氨酸結(jié)合共價(jià)片段，作者稱為 “**” 片段 (Scoutfragment)。它們能 “搜尋” 出人類蛋白組中可配體的半胱氨酸，包括一些從未被研究的泛素化連接酶。作者將 KB02、KB03、KB05 三個(gè)“**”片段連接在 FKBP12 高親和性的配體 SLF 上。發(fā)現(xiàn) KB02-SLF、KB03-SLF、KB05-SLF 均未改變胞質(zhì)蛋白 FKBP12 水平。其中，KB02-SLF 顯著降低核蛋白 FKBP12 的水平。

選擇性的 Cullin-RING 泛素連接酶 (CRL) 類 E3 連接酶抑制劑 MLN4924 阻斷了 KB02-SLF 介導(dǎo)的核 FKBP12 降解，表明 KB02-SLF 是通過(guò) CRL 的作用促進(jìn)了核定位 FKBP12 的蛋白酶體降解。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)以及 DCAF16 的 shRNA 沉默進(jìn)一步確定 CRL 類 E3 泛素化連接酶為 DCAF16。
DCAF16 在誘導(dǎo)核蛋白降解的過(guò)程中是如何被修飾的？

串聯(lián)質(zhì)譜 (MS/MS) 分析和定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)表明，KB02-SLF 是修飾了 DCAF16 的 Cys177-179 三個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)。其中 DCAF16 中的 C177 和 C179 為極有可能是介導(dǎo) FKBP12 降解的關(guān)鍵的位點(diǎn)。接下來(lái)，作者構(gòu)建的 KB02-JQ1 雙功能分子 (誘導(dǎo)核蛋白 BRD4 降解)，在敲除的 DCAF16 細(xì)胞中，KB02-JQ1 誘導(dǎo)的 BRD4 降解則被抑制。

DCAF16 的發(fā)現(xiàn)，在 CRBN 和 VHL 的蛋白降解劑的基礎(chǔ)上，拓展了蛋白降解劑的開發(fā)與應(yīng)用前景。同時(shí)，特異性促進(jìn)核蛋白的降解，避免降解了同雙功能化合物結(jié)合的胞質(zhì)蛋白。另外，較少成分的 DCAF16 修飾就可支持配體誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，而未被修飾的 DCAF16 仍然能調(diào)節(jié)其底物，使蛋白降解劑能最小化受到 DCAF16 內(nèi)源底物的干擾。

相關(guān)產(chǎn)品

MG-277

MG-277 是一種由 PROTAC 降解劑轉(zhuǎn)化而來(lái)的分子膠。MG-277 誘導(dǎo)中等程度的 MDM2 降解。MG-277 以非 p53 的方式高度有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì) RS4;11 細(xì)胞和 p53 突變體 RS4;11/IRMI-2 細(xì)胞的 IC₅₀分別為 3.5 nM 和 3.4 nM。MG-277 有效的誘導(dǎo)翻譯終止因子 GSPT1 的降解，DC₅₀ 為 1.3 nM。MG-277 具有有效的抗癌活性。

KB02-SLF

KB02-SLF 是一種核 FKBP12 降解劑 (molecular glue)。KB02-SLF 通過(guò)共價(jià)修飾 DCAF16 (E3 ligase) 促進(jìn) FKBP12 降解，并可以提高生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)降解的持久性。KB02-SLF 由 SLF 與泛素 E3 連接酶配體 (KB02) 通過(guò) linker 連接而成。
KB02-JQ1
KB02-JQ1 是一種高選擇性 BRD4 降解劑 (molecular glue)。KB02-JQ1 通過(guò)共價(jià)修飾 DCAF16 (E3 ligase) 促進(jìn) BRD4 降解，并可以提高生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)降解的持久性。KB02-JQ1 由 JQ1 與泛素E3 連接酶配體 (KB02) 通過(guò) linker 連接而成。

Pevonedistat

Pevonedistat (MLN4924) 是一種有效，選擇性的 NEDD8 活化酶 (NAE) 抑制劑，IC₅₀ 為 4.7 nM。NEDD8 活化酶參與 CRL 激活的第一步，通過(guò)激活 NEDD8 并隨后轉(zhuǎn)移到 Ubc12，NEDD8 途徑的 E2 結(jié)合酶。

參考文獻(xiàn)

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