自從2019年11月，國際學(xué)術(shù)期刊《Nature》和《Cell》相繼發(fā)表了關(guān)于染色體外環(huán)狀DNA(extrachromosomal circular DNA)的重要研究，提出了這種游離于染色體基因組之外的DNA分子攜帶癌基因并具有轉(zhuǎn)錄活性，可能是某些癌癥的一大幫兇，染色體外環(huán)狀DNA頓時(shí)成為科研界尤其是生物醫(yī)學(xué)界的關(guān)注焦點(diǎn)。今天我們就為大家詳盡介紹染色體外環(huán)狀DNA的功能及研究方法。

內(nèi)容提綱：
一、什么是染色體外環(huán)狀DNA
二、染色體外環(huán)狀DNA在腫瘤中的功能作用
1.促進(jìn)癌基因擴(kuò)增
2.促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性和耐藥性
3.促進(jìn)癌細(xì)胞基因重組
4.作為潛在分子標(biāo)志物
三、云序生物提供的環(huán)狀DNA研究服務(wù)
1.組織細(xì)胞環(huán)狀DNA測(cè)序
2.血清血漿環(huán)狀DNA測(cè)序
3.血清血漿環(huán)狀DNA甲基化測(cè)序
4.環(huán)狀DNAsanger測(cè)序
5.環(huán)狀DNA純化柱
  游離于染色體基因組之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被發(fā)現(xiàn)常常以環(huán)狀的形式存在，這種形式的DNA被稱為eccDNA (extrachromosomal circular DNA）。目前也習(xí)慣將巨大的環(huán)狀DNA(>1Mb)稱為ecDNA而將相對(duì)較小的環(huán)狀DNA稱為eccDNA。染色體外環(huán)狀DNA最早是1965年在電子顯微鏡下被觀察到，但由于技術(shù)手段的限制，對(duì)其研究難以深入，一直以來只是偶有報(bào)道，并且對(duì)它們的種類、分布以及功能沒有全面的研究。隨著技術(shù)的發(fā)展，Paul Mischel團(tuán)隊(duì)在2014年發(fā)現(xiàn)染色體外環(huán)狀DNA攜帶致癌基因EGFRvIII并且影響腫瘤的耐藥性，2017年發(fā)現(xiàn)染色體外環(huán)狀DNA在腫瘤中普遍存在。而2019年Mischel團(tuán)隊(duì)和Scacheri團(tuán)隊(duì)相繼在《Nature》和《Cell》上發(fā)表文章展示染色體外環(huán)狀DNA上攜帶的致癌基因可以高度表達(dá)，《Nature Communication》也報(bào)道了染色體外環(huán)狀DNA驅(qū)動(dòng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤致癌基因重塑，接連發(fā)表的重磅文章使染色體外環(huán)狀DNA頓時(shí)成為熱門話題和科研焦點(diǎn)。現(xiàn)有研究表明，染色體外環(huán)狀DNA廣泛存在于各種物種、組織中，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以滾環(huán)擴(kuò)增，細(xì)胞有絲分裂時(shí)由于無著絲粒因而會(huì)不均勻地分配到子細(xì)胞中，這些特點(diǎn)我們?cè)谕�期文章�?a >2020國自然研究熱點(diǎn)—eccDNA的前世今生》中做過詳盡的總結(jié)。
  從目前發(fā)表的文獻(xiàn)歸納，染色體外環(huán)狀DNA在腫瘤中的作用可主要分為以下3個(gè)功能機(jī)制，以及1個(gè)潛在的應(yīng)用方向：
1.促進(jìn)癌基因擴(kuò)增
2.促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性和耐藥性
3.促進(jìn)癌細(xì)胞基因重組
4.作為潛在分子標(biāo)志物
下面我們一起來看看這4方面的研究結(jié)果。
  染色體外環(huán)狀DNA可以攜帶完整的基因，尤其是腫瘤中染色體外環(huán)狀DNA經(jīng)常攜帶致癌基因，不受控制的表達(dá)這些基因，最終可能導(dǎo)致腫瘤的惡性增長。除了增加癌基因拷貝數(shù)，還有研究表明，染色體外環(huán)狀DNA中染色質(zhì)高度開放，并且其上存在著增強(qiáng)子序列，這些特征使染色體外環(huán)狀DNA本身轉(zhuǎn)錄活性提高，進(jìn)一步增加其上癌基因的表達(dá)。

文章1：染色體外環(huán)狀DNA促進(jìn)染色質(zhì)的開放和促癌基因的表達(dá)
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：42.778
發(fā)表時(shí)間：2019.11.20
文章鏈接：Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression
本文研究了三種人類癌細(xì)胞系和來自于TCGA的臨床腫瘤樣品，超高分辨率共聚焦顯微鏡展示了染色體外環(huán)狀DNA游離于染色體外及它們的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并將WGS測(cè)序數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合，通過單核苷酸多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)染色體外環(huán)狀DNA是癌基因中表達(dá)豐度最高的基因之一。研究發(fā)現(xiàn)在eccDNA上面染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)是高度開放的，利于基因表達(dá)，同時(shí)染色體外環(huán)狀DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致原本相距很遠(yuǎn)的DNA片段，會(huì)被連接到一起，從而能夠?qū)崿F(xiàn)超遠(yuǎn)距離的相互作用和基因調(diào)控。本研究為深入了解染色體外環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)如何影響癌基因提供了線索，并將染色體外環(huán)狀DNA與癌基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)聯(lián)系起來。

文章2：環(huán)狀染色體外DNA對(duì)癌基因的擴(kuò)增
發(fā)表期刊：Cell
影響因子：38.637
發(fā)表時(shí)間：2019.12.12
文章鏈接：Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications
本研究發(fā)現(xiàn)，致癌基因EGFR基因經(jīng)常會(huì)從染色體脫落而產(chǎn)生染色體外環(huán)狀DNA，并且EGFR和其在染色體外環(huán)狀DNA上序列上游非編碼區(qū)的增強(qiáng)子在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中共同擴(kuò)增。對(duì)多種癌種的樣本進(jìn)行同樣分析發(fā)現(xiàn)不同實(shí)體腫瘤類型中均存在類似的癌基因與增強(qiáng)子顯著共擴(kuò)增的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究證明腫瘤細(xì)胞中的癌基因通過高級(jí)擴(kuò)增與環(huán)化而形成的對(duì)自身調(diào)控活性的增強(qiáng)，是一個(gè)十分有效的促癌機(jī)制。本文揭示了染色體外環(huán)狀DNA特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及其功能，為后續(xù)的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究，奠定了重要的基礎(chǔ)。

文章3：ecDNA與致癌基因擴(kuò)增及多種癌癥不良預(yù)后相關(guān)
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發(fā)表時(shí)間：2020.08.17
文章鏈接：Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers
染色體外DNA (ecDNA)擴(kuò)增促進(jìn)腫瘤內(nèi)遺傳異質(zhì)性并加速腫瘤進(jìn)化；然而，其頻率和臨床影響尚不清楚。通過對(duì)3212名癌癥患者全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的計(jì)算分析，本文發(fā)現(xiàn)ecDNA擴(kuò)增經(jīng)常發(fā)生在大多數(shù)癌癥類型中，但不發(fā)生在血液或正常組織中。癌基因在擴(kuò)增的細(xì)胞外基質(zhì)上高度富集，最常見的復(fù)發(fā)性癌基因擴(kuò)增發(fā)生在細(xì)胞外基質(zhì)上。與拷貝數(shù)匹配的線性DNA相比，ecDNA擴(kuò)增導(dǎo)致更高水平的癌基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)染色質(zhì)可及性增強(qiáng)，更經(jīng)常地導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物融合。即使在控制組織類型的情況下，癌癥攜帶內(nèi)皮祖細(xì)胞基因的患者的生存期也明顯短于癌癥不受基于內(nèi)皮祖細(xì)胞基因的癌基因擴(kuò)增驅(qū)動(dòng)的患者。本文的結(jié)果表明，基于ecDNA的癌基因擴(kuò)增在癌癥中很常見，不同于染色體擴(kuò)增，導(dǎo)致許多癌癥類型的患者預(yù)后不良。

文章4：調(diào)控癌基因轉(zhuǎn)錄
發(fā)表期刊：Cancer Cell
影響因子：26.602
發(fā)表時(shí)間：2021.4.8
文章鏈接：Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription
本文發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者來源的神經(jīng)球和前列腺癌細(xì)胞中，ecDNAs具有廣泛的ecDNA-ecDNA間和ecDNA-染色體間互作。ecDNA-染色體互作位點(diǎn)具有廣泛、高水平的H3K27ac信號(hào)，主要集中在表達(dá)水平增加的染色體基因上。在前列腺癌細(xì)胞中加入含有特征增強(qiáng)子的合成ecDNA，導(dǎo)致染色體基因轉(zhuǎn)錄的全基因組激活。對(duì)ecDNAs的染色體靶點(diǎn)進(jìn)行單分子分辨率的解析，發(fā)現(xiàn)活躍性表達(dá)的癌基因在空間上聚集在ecDNA介導(dǎo)的互作網(wǎng)絡(luò)中。研究表明ecDNAs可以作為移動(dòng)的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，并顯示了一種潛在的合成非整倍體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
  染色體外環(huán)狀DNA由于不帶著絲粒元件，因此不能通過有絲分裂的方式均勻分配到分裂后的細(xì)胞中，而是通過不對(duì)稱分布，促進(jìn)腫瘤內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性。而且如果攜帶癌基因的拷貝數(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性及對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力有影響，那么這種異質(zhì)性會(huì)提高腫瘤內(nèi)產(chǎn)生能夠適應(yīng)環(huán)境的細(xì)胞的幾率，從而加速腫瘤的進(jìn)化。

文章1：ecDNA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)化和基因異質(zhì)性
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：42.778
發(fā)表時(shí)間：2017.3.2
文章鏈接：Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity
本文由加州大學(xué)圣地亞哥分校的Paul Mischel教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)完成，共分析了17種不同的癌細(xì)胞的ecDNA。研究發(fā)現(xiàn)人類近一半腫瘤存在ecDNA，ecDNA是腫瘤的關(guān)鍵特征，它可以編碼多種促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因。此外，他們還發(fā)現(xiàn)ecDNA上帶有的原癌基因可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，位于ecDNA上或染色體內(nèi)部的原癌基因拷貝機(jī)制有很大差異，以至于導(dǎo)致原癌基因拷貝數(shù)差異和腫瘤異質(zhì)性差異。這些特性使ecDNA在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、產(chǎn)生多樣性及耐藥性過程中發(fā)揮的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于位于染色體中的相同基因發(fā)揮的作用，即ecDNA能夠驅(qū)動(dòng)腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性。 

文章2：促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中耐藥性作用
發(fā)表期刊：Science
影響因子：41.845
發(fā)表時(shí)間：2014.1.3
文章鏈接：Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA
本文在基因?qū)用娣治隽四z質(zhì)母細(xì)胞瘤的耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ecDNA通過使腫瘤迅速改變其所含癌基因的數(shù)量，在某些腦癌耐藥性中發(fā)揮著核心作用，而且還能決定一個(gè)細(xì)胞是否會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。EGFR TKI處理后ecDNA上的EGFR基因被去除，停藥后，ecDNA上的克隆EGFR突變會(huì)再次出現(xiàn)，通過該途徑，癌細(xì)胞可以逃避針對(duì)維持在ecDNA上的癌基因的靶向治療。本研究揭示了ecDNA可能通過一種高度特異性、動(dòng)態(tài)性和適應(yīng)性的途徑幫助癌細(xì)胞逃避針對(duì)ecDNA上癌基因的藥物治療，暗示了與持續(xù)給藥相比，高劑量脈沖間歇治療可能會(huì)有更好的靶向抑制作用，同時(shí)使腫瘤恢復(fù)藥物敏感性。

文章3：促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的進(jìn)化
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發(fā)表時(shí)間：2018.5
文章鏈接：Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma
為了了解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的基因組異質(zhì)性是如何導(dǎo)致治療反應(yīng)不良的，本研究對(duì)GBM樣本、神經(jīng)球和原位異種移植模型進(jìn)行了DNA和RNA測(cè)序。數(shù)據(jù)分析顯示，ecDNA上單核苷酸變異、局部DNA改變和癌基因擴(kuò)增是從腫瘤樣品傳播到模型系統(tǒng)上的主要體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)變異。作者推斷，后代細(xì)胞對(duì)ecDNA的遺傳是不均勻的，而這一特征會(huì)影響后代細(xì)胞的致癌潛能。分析發(fā)現(xiàn)，帶有癌基因的ecDNA在整個(gè)疾病過程中經(jīng)常被保留。這些結(jié)果表明，染色體外的元素能使GBM進(jìn)化過程中基因組異質(zhì)性迅速增加，而與染色體DNA改變無關(guān)。
  早期的研究認(rèn)為染色體外環(huán)狀DNA形成是由短重復(fù)序列介導(dǎo)的，主要通過基因重組機(jī)制實(shí)現(xiàn)，而反方向上，研究揭示了染色體外環(huán)狀DNA也可重新整合到線性基因組，導(dǎo)致致癌基因重組。這些重組過程中，不僅可能發(fā)生癌基因拷貝數(shù)擴(kuò)增，而且可能使原本相距較遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件重排在鄰近區(qū)域，改變基因的表達(dá)，影響腫瘤的形成和發(fā)展。

文章1：驅(qū)動(dòng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤致癌基因組重塑
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發(fā)表時(shí)間：2019.12.16
文章鏈接：Extrachromosomal circular DNA drives oncogenic genome remodeling in neuroblastoma
本文章檢測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中eccDNA，繪制了表達(dá)譜，不僅發(fā)現(xiàn)了多種未被發(fā)現(xiàn)過的eccDNA，還發(fā)現(xiàn)eccDNA是體細(xì)胞基因組重排的主要來源。研究揭示了eccDNA通過嵌合環(huán)化和重新整合到線性基因組中的方式，導(dǎo)致致癌基因重組。這種環(huán)狀上產(chǎn)生的基因重組具有重要功能和臨床意義，如果這些發(fā)現(xiàn)能擴(kuò)展到其他癌癥并更深入地進(jìn)行一些分析，將為理解癌癥基因重塑提供新的方向。
  染色體外環(huán)狀DNA與腫瘤有如此密切的關(guān)系，有文獻(xiàn)提出了染色體外環(huán)狀DNA可能具有作為腫瘤分子標(biāo)志物的潛力。NIPT之父盧煜明教授的新研究表明：除了表達(dá)水平，環(huán)狀DNA分子的甲基化狀況也可作為一類新的分子標(biāo)志物。

文章1：母體血漿中eccDNA的鑒定
發(fā)表期刊：PNAS
影響因子：9.412
發(fā)表時(shí)間：2020.1.3
文章鏈接：Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma
文章檢測(cè)了懷孕母體血漿中的eccDNA，發(fā)現(xiàn)這些eccDNA分子長度呈雙峰分布，eccDNA整體長度要大于線性DNA，且母體來源的eccDNA長度大于胎兒來源的eccDNA。文中提出，eccDNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能使他們更加耐受限制性外切酶，因此比線性DNA更加穩(wěn)定。這一特性使eccDNA存在作為分子標(biāo)志物的潛力。

文章2：母體血漿中eccDNA甲基化的鑒定
發(fā)表期刊：Clinical Chemistry
影響因子：7.292
發(fā)表日期：2021.2
文章鏈接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance
首次揭示了eccDNA的甲基化狀態(tài)。研究比較了母體和胎兒來源的血漿eccDNA的甲基化密度，以及小分子和大分子之間的甲基化密度，并研究了胎兒eccDNA在母體循環(huán)中的清除情況。

我們可以看到eccDNA對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展在如此多方面具有潛在影響，無論是作為癌基因表達(dá)調(diào)控因子，還是新型的特異性腫瘤標(biāo)志物，eccDNA都具有極高的研究?jī)r(jià)值，近年來已成為生物醫(yī)學(xué)界火熱的明星分子。那么想要揭示eccDNA的種類、表達(dá)以及功能該從何入手呢？

云序生物2019年全國首fa組織細(xì)胞環(huán)狀DNA測(cè)序服務(wù)，基于circle-seq方法，通過柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環(huán)擴(kuò)增放大信號(hào)，高效純化富集環(huán)狀DNA，具有檢出率高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。2020年云序生物又首fa推出血清血漿環(huán)狀DNA測(cè)序服務(wù)，參考盧煜明教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的方法，充分利用Tn5轉(zhuǎn)座酶高效低損地片段化環(huán)狀DNA，實(shí)現(xiàn)血液循環(huán)系統(tǒng)中微量的環(huán)狀DNA的檢測(cè)。今年，云序生物再次全國首fa環(huán)狀DNA甲基化測(cè)序服務(wù)，用酶轉(zhuǎn)化法將未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，可同時(shí)檢測(cè)樣品中環(huán)狀DNA及其甲基化狀況。另外針對(duì)測(cè)序結(jié)果篩選出的環(huán)狀DNA，云序生物還提供sanger測(cè)序驗(yàn)證服務(wù)。
1.組織細(xì)胞環(huán)狀DNA測(cè)序
2.血清血漿環(huán)狀DNA測(cè)序
3.血清血漿環(huán)狀DNA甲基化測(cè)序
4.環(huán)狀DNA sanger測(cè)序
5.環(huán)狀DNA純化柱

1.組織細(xì)胞環(huán)狀DNA測(cè)序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環(huán)擴(kuò)增放大信號(hào)，高效地純化和富集環(huán)狀DNA，再利用NGS測(cè)序和生信分析識(shí)別環(huán)狀DNA。結(jié)合優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)流程，本環(huán)狀DNA測(cè)序服務(wù)具有檢出率高﹑準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：
Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue

實(shí)驗(yàn)流程：
1)柱純化
相對(duì)于大量存在的基因組DNA，環(huán)狀DNA在細(xì)胞中的含量非常少，因此從樣品中提取總DNA后，第一步需要通過柱純化去除基因組DNA，以免測(cè)序中基因組DNA占據(jù)大部分?jǐn)?shù)據(jù)量。柱純化這一步驟十分關(guān)鍵，既要最大限度地去除基因組DNA, 又需最大限度保留環(huán)狀DNA分子，尤其是避免丟失掉超長和超短的環(huán)狀DNA。云序生物采用A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分eccDNA高分文章中所使用的純化柱，并且云序生物是該品牌在國內(nèi)的唯yi總代理。
在最終測(cè)序結(jié)果證實(shí)檢測(cè)到的環(huán)狀DNA短至100多bp，長至9M。
2)酶消化
經(jīng)過了柱純化，依然會(huì)有少量的線性DNA殘留，因此第二步利用環(huán)狀DNA耐受限制性外切酶的特點(diǎn)，用外切酶對(duì)柱純化后產(chǎn)物進(jìn)行酶消化。對(duì)人類樣品，會(huì)特別的先使用針對(duì)人類線粒體的限制性內(nèi)切酶MssI將環(huán)狀的線粒體DNA剪切成線性DNA,再進(jìn)行外切酶消化，一并去除線粒體DNA。
3)滾環(huán)擴(kuò)增
經(jīng)過前兩步酶消化和純化，基因組線性DNA被去除，保留下來的環(huán)狀DNA因?yàn)榭偭枯^少，所以需要通過滾環(huán)擴(kuò)增放大環(huán)狀DNA信號(hào)，使之達(dá)到建庫所需的DNA量。
4)建庫測(cè)序
對(duì)純化和擴(kuò)增富集的后的環(huán)狀DNA，進(jìn)行常規(guī)的NGS高通量測(cè)序。流程包括片段化，建庫和使用Illunina NovaSeq測(cè)序儀進(jìn)行150bp雙端測(cè)序。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 使用原裝A&A biotechnology純化柱高效富集環(huán)狀DNA
• 滾環(huán)擴(kuò)增放大環(huán)狀DNA信號(hào)，提高檢出率
• 專業(yè)的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表

2.血清血漿環(huán)狀DNA測(cè)序
針對(duì)血清血漿微量樣品，云序生物參考盧煜明教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉(zhuǎn)座酶，打開eccDNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)并同時(shí)在DNA片段兩端加上接頭，進(jìn)行建庫及測(cè)序。Tn5轉(zhuǎn)座酶法效率高，損耗低，實(shí)現(xiàn)血液循環(huán)系統(tǒng)中微量的環(huán)狀DNA的檢測(cè)。并且本產(chǎn)品能保留環(huán)狀DNA的原始表達(dá)量，使得不同環(huán)狀DNA間的表達(dá)量的比較更為準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)：
Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in maternal plasma

實(shí)驗(yàn)流程：
1)環(huán)狀DNA富集：通過核酸外切酶 V 消化等手段，去除樣品中的線性DNA，從而達(dá)到富集環(huán)狀DNA的目的。
2)加接頭：通過轉(zhuǎn)座酶打開環(huán)狀DNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3)末端修復(fù)：通過Klenow酶修復(fù)轉(zhuǎn)座產(chǎn)物的末端缺口。
4)建庫測(cè)序：純化后文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 減少DNA損失
• 保留原始表達(dá)量，不同環(huán)狀DNA間表達(dá)量比較更準(zhǔn)確

3.血清血漿環(huán)狀DNA甲基化測(cè)序
針對(duì)血清血漿樣品，云序參考盧煜明教授團(tuán)隊(duì)今年研發(fā)的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉(zhuǎn)座酶，打開環(huán)狀DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)并同時(shí)在DNA片段兩端加上接頭，并用酶轉(zhuǎn)化法將未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，進(jìn)行建庫及測(cè)序。一次建庫測(cè)序中同時(shí)檢測(cè)樣品中環(huán)狀DNA及其甲基化位點(diǎn)的信息。

參考文獻(xiàn)：
Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance

實(shí)驗(yàn)流程：
1)環(huán)狀DNA富集：通過核酸外切酶 V 消化等手段，去除樣品中的線性DNA，從而達(dá)到富集環(huán)狀DNA的目的。
2)加接頭：通過轉(zhuǎn)座酶打開環(huán)狀DNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3)末端修復(fù)：通過Klenow酶修復(fù)轉(zhuǎn)座產(chǎn)物的末端缺口。
4)C-U轉(zhuǎn)化：通過溫和的酶轉(zhuǎn)化法，將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。
5)PCR擴(kuò)增：對(duì)轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及純化。
6)上機(jī)測(cè)序：純化后文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 一箭雙雕：同時(shí)檢測(cè)環(huán)狀DNA及其甲基化狀況，節(jié)約樣品，性價(jià)比高
• 單堿基分辨的環(huán)狀DNA甲基化分析

4.環(huán)狀DNA sanger測(cè)序
針對(duì)測(cè)序項(xiàng)目中篩選出的環(huán)狀DNA，云序提供sanger測(cè)序服務(wù)驗(yàn)證環(huán)狀結(jié)構(gòu)。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴(kuò)大樣品量驗(yàn)證手段，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。通過設(shè)計(jì)反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將覆蓋環(huán)狀DNA連接位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序，驗(yàn)證連接位點(diǎn)處序列。

原理：
針對(duì)環(huán)狀DNA的break point設(shè)計(jì)反向引物

結(jié)果展示：

5.環(huán)狀DNA純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環(huán)狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內(nèi)的唯yi總代理。