圖 1. 瓊脂糖珠

在無(wú)需抗體飽和的情況下，瓊脂糖珠能很好的結(jié)合極大量目的蛋白。但值得注意的是，在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，抗體的量常常不足以滿足瓊脂糖珠的飽和荷載量，沒(méi)有被抗體覆蓋的瓊脂糖珠的部分則可以自由地結(jié)合任何可粘附的物質(zhì)，這種非特異性結(jié)合升高引起背景信號(hào)升高，這時(shí)，“高荷載量?jī)?yōu)勢(shì)”會(huì)變成“高荷載量劣勢(shì)”。對(duì)裂解樣本進(jìn)行預(yù)處理操作，是去除非特異性結(jié)合物最為簡(jiǎn)單有效的方法。

■ 預(yù)處理

裂解樣本是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸的混合物，與抗體、蛋白 A/G、微珠材料會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，從而對(duì)免疫沉淀結(jié)果造成影響。主要方法有兩種：

a. 排除由于微珠本身材質(zhì)引起的非特異性結(jié)合：將裂解樣本與微珠單獨(dú)混合孵育，隨后去除微珠并收集上清液，再進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。

b. 排除由細(xì)胞成分引起的非特異性結(jié)合：使用相同抗體亞型類(lèi)別但不靶向目的蛋白的抗體，在相同的組分條件中與裂解樣本混合孵育，再進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。

■ 結(jié)合能力

■ 成本

瓊脂糖珠：瓊脂糖珠必須通過(guò)離心濃縮在管底部，并在每次孵育和洗滌除去上清液，通常需要肉眼識(shí)別管底部的瓊脂糖珠，因此，每個(gè)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)至少需要使用 25-50 μL 的瓊脂糖珠。

磁珠：采用磁性分離，無(wú)需設(shè)定最小體積的的磁珠使用量，用量?jī)H取決于目的蛋白和免疫沉淀抗體。

當(dāng)然，在使用瓊脂糖珠的過(guò)程中，可以使用過(guò)濾離心柱代替普通的微量離心管，該離心柱包含一個(gè)過(guò)濾器，允許通過(guò)短暫的離心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流過(guò)，因此可以顯著減少每個(gè)反應(yīng)所需的瓊脂糖珠使用量。

■ 簡(jiǎn)單快速

■ 自動(dòng)化