2021年4月29日日內(nèi)瓦大學(xué)Ramesh S. Pillai、David Homolka研究組合在著名學(xué)術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表了一項新成果，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)剪接位點m6A甲基化通過阻止剪接因子U2AF35與前體mRNA結(jié)合進(jìn)而抑制RNA剪接，結(jié)合后續(xù)的功能機制研究，揭示了m6A甲基化修飾新的調(diào)控機制。接下來，就讓我們一起來看下研究人員是如何利用高通量測序技術(shù)RNA-seq和m6A-MeRIP-seq揭示m6A甲基化修飾調(diào)控RNA剪接這一新功能的。

 

發(fā)表期刊：Cell
發(fā)表日期：2021年4月29日
影響因子：41.582
研究方法：：m6A meRIP-seq、RNA-seq、LC-MS/MS等
文章鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33930289/

 

文章概要

6-methyladenosine (m6A) RNA修飾被廣泛用于改變mRNA的命運。本文中作者證明了秀麗隱桿線蟲的甲基化修飾蛋白METT-10（小鼠METTL16的同源蛋白）沉積在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶前體mRNA的3’剪接位點(AG)上的一個m6A修飾，可抑制其正確剪接和蛋白產(chǎn)生。這種機制是由豐富的飲食觸發(fā)的，以m6A介導(dǎo)的開關(guān)來停止SAM的產(chǎn)生并調(diào)節(jié)其內(nèi)穩(wěn)態(tài)。雖然哺乳動物SAM合成酶pre-mRNA不受此機制調(diào)控，但3’剪接位點m6A修飾抑制剪切在哺乳動物中是保守的。該修飾通過物理方式阻止必要的剪接因子U2AF35識別3’剪接位點。作者認(rèn)為使用剪切位點m6A修飾是一種古老的剪接調(diào)節(jié)機制。
 
 
研究思路

研究內(nèi)容

一、秀麗隱桿線蟲的m6A轉(zhuǎn)錄組
已知哺乳動物中主要有兩類m6A“編寫器”:METTL3/METTL14復(fù)合物以及METTL16，為了研究 METTL16 催化活性的保守作用，作者選擇了秀麗隱桿線蟲（以下稱為蠕蟲）。蠕蟲直系同源物 METT-10包含高度保守的 RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶域，但缺乏哺乳動物 METTL16 中發(fā)現(xiàn)的 VCR域（圖 1A）。通過LC-MS/MS技術(shù)檢測來自成蟲的總 RNA 和 poly(A)+ RNA 中的各種核糖和堿基修飾發(fā)現(xiàn)，在來自所有三種生物來源的 poly(A)+ RNA 中檢測到 m6 A 修飾，包括秀麗隱桿線蟲（圖 1B）。為了鑒定攜帶 m6A 甲基化的蠕蟲轉(zhuǎn)錄本，作者使用來自成年秀麗隱桿線蟲的 poly(A)+ RNA 和小鼠睪丸 RNA （陽性對照）的混合物進(jìn)行了  m6A-meRIP-seq（圖 1C）與超過 20,000 個小鼠峰相比，在蠕蟲 poly(A)+ 轉(zhuǎn)錄組中僅鑒定出 176 個 m6A 峰（圖 1D-E），這可能是由于蠕蟲中不存在 METTL3/METTL14 “編寫器”復(fù)合體。
 
二、蠕蟲 METT-10 是 U6 snRNA 和 SAM 合成酶 mRNA 的 m6A “編寫器”

在確認(rèn)蠕蟲 poly(A)+ RNA上存在 m6A 后，作者接下來尋找METT-10甲基化靶標(biāo)，首先使用了m6A-meRIP-seq數(shù)據(jù)集的比較分析來鑒定 poly(A)+ 轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本在METT-10 敲除 (KO) 突變體中顯示m6A 甲基化減少（圖 2F）。其中，前 20 個編碼 U6snRNA 序列（圖2G）。與此一致，對總 RNA 樣本進(jìn)行的單獨 m6A-meRIP-seq實驗顯示 U6 snRNA 讀數(shù)的富集程度更高（圖 2H）。已有研究表明人類 U6 snRNA 在九聚體基序 (UACm6AGAGAA) 內(nèi)被人 METTL16 甲基化，在此m6A-meRIP-seq讀數(shù)的映射顯示蠕蟲 U6 snRNA 也在相同的位點（圖2I）。重要的是，這個 m6A 信號在 METT-10 KO 突變體中消失（圖 2H 和2I）。作為獨立驗證，通過 SCARLET 方法（以核苷酸特異性方式檢測甲基化狀態(tài)），對成蟲總 RNA 的分析證實了甲基化共有基序中這種特定腺苷（A）的甲基化（圖2J）。此外，在 METT-10 KO 中顯示 m6A水平顯著下降的其他轉(zhuǎn)錄本是 sams-3、sams-4 和 sams-5（圖2G），這些重復(fù)的基因編碼 SAM 合成酶，該酶負(fù)責(zé)產(chǎn)生甲基供體 SAM，這是細(xì)胞中甲基化反應(yīng)所必需的。綜上，作者將蠕蟲 METT-10 鑒定為 m6A RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，并且與其哺乳動物直系同源物 METTL16 一樣，它具有 U6 snRNA 和 SAM 合成酶 RNA兩個保守靶點。
 
三、3’剪接位點 m6A 修飾抑制 SAM 合成酶前體 mRNA 的剪接

作者通過將m6A-meRIP-seq數(shù)據(jù)集映射到蠕蟲基因組，在sams m6A峰上發(fā)現(xiàn)了一個甲基化基序(UACm6AGAAAC)，其中該基序中的甲基化腺苷位于內(nèi)含子2的3’剪接位點(AG)(圖3A)。除了sams-3/4轉(zhuǎn)錄本的成熟剪接蛋白編碼型(PC亞型)，作者還檢測到了兩個未使用內(nèi)含子2內(nèi)3’剪接位點的非編碼型：使用上游隱藏的3’剪接位點的替代剪接變異體(AS亞型) 和內(nèi)含子保留型(IR亞型) (圖3C)。其中，與野生型(WT)蠕蟲相比，METT-10 KO中內(nèi)含子2的總體含量較低，表明在沒有3‘剪接位點甲基化時，其有效剪接(圖3B)。與此一致的是，RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，METT-10 KO中優(yōu)先使用3’剪接位點(產(chǎn)生PC亞型) (圖3C)。這種m6A介導(dǎo)的剪接抑制的結(jié)果是METT-10 KO中sams mRNA水平普遍增加(圖3D)。綜上所述，蠕蟲通過METT10介導(dǎo)的3’剪接位點m6A甲基化來抑制SAM合成酶mRNA的剪接和產(chǎn)生。
 
四、一個保守的包含3’剪接位點甲基化共識基序的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)是被METT-10甲基化修飾所必需的

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，跨越3’剪接位點的sams-3 pre-mRNA的30-nt RNA片段折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，甲基化共識基序(UACm6AGAAAC)占據(jù)了部分環(huán)區(qū)(圖4A)。為了證實該序列可以被蠕蟲METT-10甲基化，作者將這30-nt RNA與重組全長蠕蟲METT-10和放射性14C-SAM作為甲基供體孵育，發(fā)現(xiàn)RNA在3’剪接位點(AG)特異性甲基化，其中腺苷、共識基序內(nèi)的單一或三重突變消除了METT-10的體外甲基化活性(圖4B)。莖稈區(qū)域?qū)�甲基化也很關(guān)鍵，將莖環(huán)區(qū)域堿基突變后失去甲基化活性 (圖4C)。這些結(jié)果表明，sams pre-mRNA的甲基化共識基序和3’剪接位點的莖環(huán)形成是其被METT-10識別的先決條件。
五、蠕蟲通過甲基化SAM合成酶轉(zhuǎn)錄子的3’剪接位點下調(diào)SAM合成酶的表達(dá)以響應(yīng)高營養(yǎng)飲食
上述實驗3’剪接位點甲基化介導(dǎo)的剪接抑制，蠕蟲是在高營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的，而將飲食改為低營養(yǎng)瓊脂平板后導(dǎo)致WT和METT-10 KO蠕蟲失去了這種剪接調(diào)控和類似的亞型表達(dá)模式(圖5A)。為了直接確定剪接位點m6A甲基化對飲食變化的響應(yīng)，作者用來自WT和METT-10 KO蠕蟲的poly(A)+ RNA進(jìn)行了m6A-meRIP-seq實驗，這些poly(A)+ RNA來自兩種不同的飲食，發(fā)現(xiàn)生長在高營養(yǎng)培養(yǎng)皿中的WT蠕蟲sams-3 pre-mRNA內(nèi)含子2的3’剪接位點發(fā)生強m6A甲基化修飾，而低營養(yǎng)培養(yǎng)皿中甲基化顯著降低(圖5B)。因此，3'剪接位點m6A甲基化是對高營養(yǎng)飲食的反應(yīng)，以抑制SAM合成酶pre-mRNA適當(dāng)?shù)募艚雍捅磉_(dá)。由于RNA甲基化依賴于SAM作為甲基供體，作者還研究了該途徑是否通過反饋抑制來調(diào)節(jié)細(xì)胞SAM水平。代謝組學(xué)分析顯示，盡管WT蠕蟲能夠控制SAM水平，但METT10 KO蠕蟲卻不能，METT-10的丟失破壞了這種穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致兩種飲食條件下SAM濃度升高 (圖5E)。通過WB實驗檢測了該酶的蛋白水平，與RNA分析一致，高營養(yǎng)飲食條件下的SAMS-3蛋白水平下降 (圖5F)。因此，m6A修飾調(diào)控了蠕蟲SAM內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

六、 m6A甲基化阻止了必需剪接因子U2AF35對剪接位點的識別

在后生動物中，剪接因子對pre-mRNA內(nèi)的關(guān)鍵順式元件的識別是剪接起始的關(guān)鍵。U2AF是由U2AF35和U2AF65亞基組成的異二聚體，其中U2AF35已被證明直接結(jié)合AG二核苷酸的3‘剪接位點，因此作者想研究3’剪接位點甲基化是否會阻礙U2AF35的結(jié)合。等溫量熱法(ITC)實驗顯示，U2AF35與未甲基化的RNA相互作用強烈，但3’剪接位點m6A的存在使其親和力降低了一個量級。因此，3’剪接位點m6A修飾通過物理上阻止必需剪接因子U2AF35對其的識別進(jìn)而抑制pre-mRNA的正確剪接。
七、3ʹ剪切位點m6A甲基化也抑制哺乳動物細(xì)胞的剪接且METTL16的RNA m6A甲基化活性對發(fā)育至關(guān)重要
那么，m6A介導(dǎo)的抑制通路在哺乳動物系統(tǒng)中是否也存在呢？作者將基于蠕蟲sams-3的轉(zhuǎn)基因報告子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到人HeLa細(xì)胞中，通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)與在蠕蟲中表達(dá)相同構(gòu)建體時有著相似的剪接模式，且甲基化共識基序突變體AS亞型水平降低，發(fā)生有效剪接（圖7A）。為了證明剪接調(diào)控是由于m6A修飾的存在，在3’剪接位點人工引入了一個m6A，并進(jìn)行體外剪接試驗。發(fā)現(xiàn)未甲基化底物正常剪接，而3’剪接位點m6A修飾的底物顯示缺少套索中間體和成熟剪接產(chǎn)物 (圖7B)。已知METTL16缺失會導(dǎo)致小鼠植入前胚胎死亡，為了檢測其催化活性的體內(nèi)相關(guān)性，創(chuàng)建了一個攜帶催化基序突變體的基因敲入小鼠，發(fā)現(xiàn)純合子催化活性和RNA結(jié)合活性丟失的METTL16突變體表現(xiàn)出發(fā)育致死率(圖7C)。此外，METTL16條件性缺失（cKO）的小鼠會導(dǎo)致睪丸萎縮和生殖細(xì)胞發(fā)育受阻(圖7D-E)。以上實驗揭示了哺乳動物中3’剪接位點m6A甲基化的剪接抑制是保守的，以及METTL16催化活性在小鼠發(fā)育過程中的重要作用。

文章小結(jié)
文章通過m6A meRIP-seq、RNA-seq以及LC-MS/MS等技術(shù)揭示了3ʹ剪接位點的m6A 甲基化通過阻止必需剪接因子U2AF35對RNA的識別，從而抑制線蟲和哺乳動物中的前體mRNA 剪接。在蠕蟲中，這種機制用于調(diào)節(jié)剪接以響應(yīng)飲食的變化。m6A修飾參與調(diào)控多種生物學(xué)功能，其調(diào)控機制異常還可能導(dǎo)致相關(guān)疾病或癌癥的發(fā)生，本文3ʹ剪接位點m6A 甲基化剪接調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn)將有助于以后對這些相關(guān)生物學(xué)功能或疾病的探索。

 

云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6ARNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
●  m6A 全轉(zhuǎn)錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
●  m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
●  m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
●  m6A  mRNA測序
●  m6A  miRNA測序
02 檢測整體m6ARNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實現(xiàn)一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標(biāo)蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機制。

 

云序生物服務(wù)優(yōu)勢
優(yōu)勢一：發(fā)表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化測序服務(wù)平臺。云序已累計支持客戶發(fā)表52+篇高水平文章，合計影響因子450分+，是國內(nèi)支持發(fā)文最多、累計影響因子最高的公司。
優(yōu)勢二：至今完成4000+例m6A測序樣本，全面覆蓋醫(yī)口、農(nóng)口等各類樣本。
優(yōu)勢三：全面檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢四：提供m6A一站式服務(wù)：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優(yōu)勢五：率先研發(fā)超微量MeRIP測序技術(shù)，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢六：國內(nèi)最全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙�；�和2'-O-甲基化測序。