磷酸化蛋白組生信分析
Levene和Alsberg在1906年首次發(fā)現(xiàn)了蛋白的磷酸化，這個PTM在近30年后被定位到蛋白的絲氨酸殘基上（如圖1）。由于四個領(lǐng)域的平行發(fā)展：(i)二維凝膠電泳(2D-PAGE)；(ii)質(zhì)譜方法；(iii)蛋白數(shù)據(jù)庫；(iv)生物信息學(xué)工具，蛋白質(zhì)組學(xué)研究在1990年代中期開始[1]。
最常見的蛋白質(zhì)磷酸化包括與絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基側(cè)鏈形成磷酸酯鍵。兩種拮抗酶系統(tǒng)（激酶和磷酸酶）分別催化蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化[2]。磷酸化被分為四類：O-phosphorylation(pSer, pThr, pTyr), N-phosphorylation(pHis, pArg, pLys), phosphoanhydride(pAsp, pGlu) and phosphorothioate (pCys)（見圖2）[3]。
蛋白質(zhì)磷酸化是許多細(xì)胞過程中的基本調(diào)節(jié)機(jī)制，磷酸化的異常擾動與各種人類疾病有關(guān)。因此，能夠?qū)α姿峄鞍踪|(zhì)組進(jìn)行全系統(tǒng)定量分析將為揭示感興趣的疾病的新信號通路、藥物靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物提供強(qiáng)大的推動力。
圖1 早期磷酸化研究簡史[1]
圖2 磷酸化修飾位點(diǎn)示意圖[3]
1.韋恩圖
不同處理組之間的共性和差異通�？梢杂庙f恩圖展示[4]。BioVenn1能表現(xiàn)出不同組的元素數(shù)量以及相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，同時展現(xiàn)數(shù)據(jù)集的大小。
圖3 BioVenn-1
圖4 BioVenn-1
2.火山圖
在CHO-K1細(xì)胞適應(yīng)無谷氨酰胺培養(yǎng)基的生長的實(shí)驗(yàn)中，用火山圖來表示組間差異表達(dá)蛋白的表達(dá)量變化，閾值設(shè)置為fold change < 1.5和p value < 0.05[5]（如Volcano Plot-1）。并在圖中標(biāo)注TOP10差異表達(dá)蛋白。在實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)量高且顯著性高的差異蛋白是容易被關(guān)注的，并被選為目標(biāo)蛋白。這也能降低后續(xù)的實(shí)驗(yàn)難度。
圖5 Volcano Plot-1[5]
圖6 Volcano Plot-2[6]
3.KEGG Pathway分析
磷酸化水平晝夜規(guī)律波動的肝臟蛋白顯著富集在特定的代謝通路上，如胰島素相關(guān)代謝途徑、細(xì)胞自噬和晝夜節(jié)律相關(guān)的代謝途徑（如圖KEGG PATHWAY1-2），圖中橫坐標(biāo)為富集程度Rich factor值，縱坐標(biāo)表示矯正后的P-value值的大小，表明翻譯后修飾在晝夜節(jié)律調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。
圖7 KEGG pathway-1[7]
圖8 KEGG pathway-2[8]
4.GO分析
GO分析旨在發(fā)掘與基因差異表達(dá)現(xiàn)象關(guān)聯(lián)的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。下面我們以辣椒的三個不同成長階段為例，以直方圖的形式展示了GO分析的結(jié)果。圖中橫坐標(biāo)為映射差異表達(dá)蛋白的個數(shù)，縱坐標(biāo)為GO Term。
圖9 GO-1[9]
圖10 GO-2[10]
圖11 GO-3[8]
5.亞細(xì)胞定位
蛋白質(zhì)必須轉(zhuǎn)運(yùn)到其應(yīng)在的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上才能行使其功能，否則就會出現(xiàn)機(jī)體功能紊亂，產(chǎn)生各種疾病。蛋白質(zhì)的位置是蛋白質(zhì)最重要的屬性之一，有助于確定蛋白質(zhì)功能，揭示分子交互機(jī)理、理解復(fù)雜生理過程和開發(fā)藥物靶標(biāo)等方面的研究。
圖12 Subcellular Location[11]
6.PCA分析
主成分分析 (PCA, principal component analysis)是一種數(shù)學(xué)降維方法, 利用正交變換 (orthogonal transformation)把一系列可能線性相關(guān)的變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的新變量（也稱為主成分），從而利用新變量在更小的維度下展示研究對象的特征。用少數(shù)幾個主成分的變化來近似代替原來多個變量的變化。通過主成分分析，可以反映不同樣本間的關(guān)系；對于大量樣本，通過離群點(diǎn)，判斷是否存在離散樣本，在進(jìn)一步的分析中進(jìn)行剔除。
圖13 PCA[12]
7.PPI分析
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(Protein-Protein Interaction Network Analysis, PPI Network Analysis)，是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)在行使生物功能時通過形成PPI網(wǎng)絡(luò)以維持時間和空間上的協(xié)調(diào)一致，構(gòu)建差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以從蛋白質(zhì)組層面發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白的變化趨勢，進(jìn)一步幫助我們尋找差異表達(dá)蛋白中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。
8.Motif分析
酶對特定底物的部分生化偏好可能是由修飾位點(diǎn)周圍的殘基決定的，這種蛋白或多肽序列形成的特定殘基模式稱為基序（Motif）在蛋白的同源序列中，不同位點(diǎn)的保守程度是不一樣的，一般來說，對蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)影響比較大的位點(diǎn)會比較保守，其它位點(diǎn)則不是很保守。這些保守的位點(diǎn)就稱為“模體(motif)”�？梢愿鶕�(jù)蛋白質(zhì)序列特征（比如基于蛋白質(zhì)基序）進(jìn)行功能預(yù)測。
圖16 motif-1[15]
圖17 motif-2
9.激酶(kinase)預(yù)測分析
蛋白激酶（protein kinases，簡稱PK）。催化蛋白質(zhì)磷酸化過程的酶。蛋白質(zhì)的磷酸化過程是神經(jīng)信息在細(xì)胞內(nèi)傳遞的最后環(huán)節(jié)，導(dǎo)致離子通道蛋白及通道門的狀態(tài)變化。因此，激酶的變化與癌癥和疾病密切相關(guān)。在磷酸化蛋白組分析中，通常利用motif來預(yù)測激酶，揭示參與分子過程的參與者。常用預(yù)測激酶網(wǎng)站：http://hprd.org/PhosphoMotif_finder。
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