在過去的幾十年里，基因治療在治療遺傳性疾病方面取得了重大進(jìn)展。以基因組學(xué)或蛋白組學(xué)的方式找到致病基因，再結(jié)合細(xì)胞水平或動(dòng)物水平驗(yàn)證，用這種模式產(chǎn)出的高質(zhì)量文章層出不窮。今天，小賽就借一篇文獻(xiàn)和大家聊聊點(diǎn)突變疾病研究的基本套路。

文章梗概
法洛四聯(lián)癥（TOF）是最常見的紫紺型先天性心臟病，通常被認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果�；颊咧毕涤H屬和后代的先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)增加，說明了遺傳因素的貢獻(xiàn)。然而，對大多數(shù)患者而言，遺傳因素仍然難以捉摸。

人們之前發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號傳導(dǎo)的失調(diào)與法洛四聯(lián)癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)一些患者編碼血管內(nèi)皮生長因子受體2的基因（KDR）存在罕見變異。不過，他們并不清楚KDR變異在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制中的作用。

荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)中心領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)國際研究團(tuán)隊(duì)近日在《Genetics in Medicine》雜志上發(fā)表文章，報(bào)道了KDR基因變異在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，罕見的KDR變異，特別是蛋白截短變異，與法洛四聯(lián)癥密切相關(guān)。未來在臨床診斷中可以考慮對法洛四聯(lián)癥患者進(jìn)行KDR篩查。
 

獲得候選突變基因
在這項(xiàng)研究中，研究人員首先對一個(gè)摩洛哥血統(tǒng)的家族進(jìn)行了外顯子組測序，該家族有兩個(gè)孩子患有嚴(yán)重的法洛四聯(lián)癥（圖1）。測序結(jié)果顯示兩名患者攜帶85個(gè)非同義或剪接位點(diǎn)變異，而且沒有一個(gè)是純和的。由于該家族疑似隱性遺傳，研究人員優(yōu)先考慮雙等位基因變異。兩個(gè)基因包含多個(gè)罕見的變異。在對親本中的變異進(jìn)行測試后，僅剩下一組經(jīng) Sanger 測序驗(yàn)證的 KDR 復(fù)合雜合變異：KDR-p.(Gly345Trp)和KDR-p.(Gly537Arg)。另一個(gè)未患病的姐妹沒有攜帶任何KDR變異。
 

圖1. 家族譜系。兩個(gè)受影響的孩子用黑色符號標(biāo)記，未受影響的父母和兄弟姐妹用白色符號標(biāo)記。

KDR基因編碼了血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）。此次發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)變異位于VEGFR2的胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域4和5中，并且受影響的殘基在進(jìn)化上是保守的。此外，他們還在其他生物樣本庫中發(fā)現(xiàn)了帶有罕見KDR變異的法洛四聯(lián)癥患者。

構(gòu)建點(diǎn)突變小鼠進(jìn)行驗(yàn)證
之后，研究人員委托賽業(yè)生物利用CRISPR-Cas9靶向系統(tǒng)生成了基因敲入小鼠品系，每個(gè)品系分別攜帶了兩個(gè)KDR變異的小鼠同源物。他們發(fā)現(xiàn)，Kdr-p.(Gly535Arg)與KDR-p.(Gly537Arg)同源）純合敲入小鼠再現(xiàn)了Kdr缺失小鼠的表型，表明這種純合變異對發(fā)育有嚴(yán)重的影響。胚胎切片的免疫熒光染色顯示 VEGFR2 在突變胚胎的心內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中聚集，這在野生型同窩仔中基本上不存在（圖 2d），其中 VEGFR2 主要定位于細(xì)胞膜。
 

圖2. 攜帶KDR變異的點(diǎn)突變小鼠的表型

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
為了闡明兩個(gè)KDR變異的生物學(xué)機(jī)制，研究人員隨后分析了VEGFR2上酪氨酸1175（Tyr1175）位點(diǎn)的磷酸化。這是VEGFR2的主要磷酸化位點(diǎn)之一，對下游信號級聯(lián)中蛋白質(zhì)的募集至關(guān)重要。

他們用VEGF165來刺激異源表達(dá)兩個(gè)變異或野生型KDR（對照）的HEK 293T細(xì)胞。Western blot分析結(jié)果表明，與野生型相比，這兩個(gè)變異導(dǎo)致Tyr1175位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低。同樣地，對于來自敲入小鼠胚胎的卵黃囊細(xì)胞，VEGFR2的磷酸化水平也明顯降低。其中，KDR-p.(Gly537Arg)變異的功能影響更為嚴(yán)重。
 

圖3. 磷酸化分析

總的來說，來自該家族的遺傳數(shù)據(jù)以及在小鼠和體外獲得的數(shù)據(jù)支持該家族中兩種罕見的 KDR 錯(cuò)義變體的作用，其中 KDR-p.(Gly537Arg) 變體的功能影響比 KDR-p.(Gly345Trp) 的嚴(yán)重。

臨床驗(yàn)證
最后，研究人員通過比較罕見變異在法洛四聯(lián)癥患者和對照上的負(fù)荷來探索KDR變異的致病作用。他們對一組共1,569名歐洲血統(tǒng)的法洛四聯(lián)癥患者開展變異負(fù)荷分析。與對照組相比，法洛四聯(lián)癥患者出現(xiàn)蛋白質(zhì)截短變異（PTV）的比例大約高了46倍。1,569個(gè)病例中有9個(gè)PTV，而56,699個(gè)對照中有7個(gè)PTV（P = 7 × 10-11）。同時(shí)，法洛四聯(lián)癥患者的KDR錯(cuò)義變異比例也更高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

小結(jié)
作者認(rèn)為，罕見的KDR變異，特別是蛋白質(zhì)截短變異，與法洛四聯(lián)癥密切相關(guān)，可能存在不同的遺傳模式。有了遺傳學(xué)以及體內(nèi)外功能分析的支持，他們認(rèn)為VEGFR2的功能缺失是引起法洛四聯(lián)癥的機(jī)制之一，未來在臨床診斷中可考慮對法洛四聯(lián)癥患者進(jìn)行KDR篩查。

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中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌課題組與交通大學(xué)國際婦幼保健院黃荷鳳團(tuán)隊(duì)在Circulation雜志上發(fā)表了題為“In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia” 的文章。發(fā)現(xiàn)了AAV-CRISPR/Cas9系統(tǒng)對攜帶Ldlr突變的小鼠（賽業(yè)生物構(gòu)建）進(jìn)行的LDLR基因校正能夠部分地修復(fù)LDLR表達(dá)并有效改善LDLR突變體中的動(dòng)脈粥樣硬化，為FH患者的治療提供潛在的治療方法。
 

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原文檢索：

Škorić-Milosavljević, D., Lahrouchi, N., Bosada, F.M. et al. Rare variants in KDR, encoding VEGF Receptor 2, are associated with tetralogy of Fallot. Genet Med (2021). https://doi.org/10.1038/s41436-021-01212-y