在我們研究基因功能的時候，基因敲除（Knock out，KO）是實(shí)現(xiàn)基因loss of function的重要調(diào)控方式。相比于傳統(tǒng)的基因干擾（RNAi）技術(shù)，基因敲除可完全消除目的基因的表達(dá)，最終使其蛋白完全不表達(dá)或功能徹底喪失，也讓我們可以更好地觀察細(xì)胞表型的變化。

但對于基因敲除細(xì)胞模型你可能存在許多疑惑，賽業(yè)生物細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理整理了部分關(guān)于基因敲除細(xì)胞模型大家常問的問題并做出了解答�？纯茨愕膯栴}是否已在下面得到解答。如果你還有其他問題需要解答，歡迎聯(lián)系我們。

Q1  實(shí)現(xiàn)基因loss of function，我是要做敲低（RNAi）還是敲除？

A:
1）當(dāng)敲除可能會導(dǎo)致細(xì)胞增殖非常緩慢或停止生長，或在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的cell pool階段檢測效率呈顯著下降趨勢，即可判定可能出現(xiàn)敲除致死的情況，建議用RNAi；

2）由于存在部分強(qiáng)功能蛋白，即使表達(dá)下調(diào)了，仍然有較強(qiáng)的功能，如果RNAi始終做不出表型，但從有關(guān)信息推測這個基因很大可能性會出表型，建議做KO；另外，研究目的基因處于非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，或者目的基因有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄效率，也是無法用RNAi進(jìn)行有效干擾的，則只能做KO，且KO細(xì)胞更適合進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)；

3）最后，敲低跟敲除不是二選一的關(guān)系。當(dāng)我們用RNAi做了基因敲低，觀察到細(xì)胞表型的變化后，仍然可以進(jìn)一步做敲除，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)論更加有說服性。

Q2  KO單克隆與KO cell pool的區(qū)別？
A:
KO單克隆是指所有細(xì)胞均由一個測序驗(yàn)證的純合子細(xì)胞增殖而來的，所有細(xì)胞的基因型都是一樣的。KO cell pool是指沒經(jīng)過單克隆化和篩選的細(xì)胞池，因此可以理解為這群細(xì)胞中包含KO純合子，雜合子和野生型，我們在拿到KO cell pool后須根據(jù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需求挑取單克隆。

當(dāng)需要去除細(xì)胞群體干擾因素的時候，推薦使用單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，其基因組背景相對單一，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾因素小。當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)研究時，需考慮細(xì)胞群體因素，同時由于不同細(xì)胞個體差異大，而且不同整合位點(diǎn)的單克隆細(xì)胞株表現(xiàn)出來的細(xì)胞行為可能不一致，所以許多實(shí)驗(yàn)使用混合克隆株更能去除細(xì)胞間差異造成的干擾。因此，選擇單克隆細(xì)胞株還是混合克隆細(xì)胞株，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩�定�?br />
Q3  移碼突變和片段敲除哪個能更好的破壞目的蛋白的功能結(jié)構(gòu)域？

A:
雖然主觀上我們很容易認(rèn)為片段敲除對于蛋白功能域的影響更大，但其實(shí)移碼跟片段敲除很多時候均可以達(dá)到理想的敲除效果。

無論是片段敲除還是移碼突變均要考慮敲除片段是否為非3的倍數(shù)。即片段敲除除了要考慮敲除的片段區(qū)域之外，也要考慮敲除的區(qū)域能否引起移碼突變。如果敲除的片段不能引起移碼突變，蛋白僅僅是缺失了敲除區(qū)域?qū)��?yīng)的氨基酸序列，但蛋白的其他區(qū)域并不受影響。
 

Q4  是否可以一定確保蛋白不表達(dá)？

A:
首先保證蛋白不表達(dá)從科學(xué)的角度上來講，無論是采用移碼突變還是片段敲除都不可能什么細(xì)胞或基因都保證蛋白不表達(dá)。例如移碼突變的mRNA可能發(fā)生可變剪切，直接跳過移碼部位進(jìn)行翻譯，導(dǎo)致蛋白有表達(dá)；或者蛋白表達(dá)功能域的位點(diǎn)剛好處于切割位點(diǎn)更靠前的區(qū)域等。

因此我們不會草率地說我們保證蛋白不表達(dá)，這是有悖于科學(xué)原理的，但我們可通過最優(yōu)的gRNA設(shè)計(jì)，從根源上避免蛋白殘留問題，再結(jié)合抗體分析，及實(shí)驗(yàn)過程中階段性WB測試，為您提供科學(xué)的解決方案，讓您不再為KO細(xì)胞蛋白殘留問題而發(fā)愁。

Q5  如果要做KO的回復(fù)實(shí)驗(yàn)，該怎么設(shè)計(jì)方案？

A:
首先，需要做回復(fù)實(shí)驗(yàn)的KO細(xì)胞，其建立不建議穩(wěn)轉(zhuǎn)gRNA+移碼的策略，這是由于Cas9持續(xù)表達(dá)，gRNA又是作用于外顯子上的體系，回復(fù)的時候移碼突變必須要做cDNA的突變，也就是同義突變，將CRISPR識別的PAM序列去掉，否則cDNA也會被切割掉。另外，片段敲除則是2條gRNA在內(nèi)含子上切割，在cDNA上沒有識別切割位點(diǎn)，所以再進(jìn)行過表達(dá)的回復(fù)實(shí)驗(yàn)就相對比較順利。

賽業(yè)生物細(xì)胞基因編輯技術(shù)

Smart-CRISPR™

賽業(yè)生物獨(dú)創(chuàng)Smart-CRISPR™技術(shù)，是基于人工智能的AlphaKnockout基因編輯專家系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術(shù)自主開發(fā)的細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，相比普通CRISPR/Cas9技術(shù)的基因切割效率更高，可輕松實(shí)現(xiàn)細(xì)胞移碼突變、片段敲除、多基因敲除等多種敲除策略，更好地解決蛋白陽性殘留等問題，基因編輯效率顯著提升，助力您發(fā)文更快速！歡迎大家聯(lián)系我們咨詢~