文章導(dǎo)讀
近年來(lái)研究表明缺血后血管生成是血流恢復(fù)和缺血組織修復(fù)的關(guān)鍵。N6 -甲基腺苷(m6A)在許多生物過(guò)程中起著重要作用，但m6A對(duì)缺血后血管生成的影響及相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。本期分享云序客戶上海中山醫(yī)院心內(nèi)科葛均波院士課題組發(fā)表的“Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A”文章，運(yùn)用MeRIP-seq和RNA-seq的方法探討了ALKBH5在缺血性血管生成中的作用，證明其通過(guò)m6A依賴的方式調(diào)控WNT5A mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和穩(wěn)定，該結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向ALKBH5可能是包括外周動(dòng)脈疾病在內(nèi)的缺血性疾病的潛在治療選擇，為揭示m6A修飾在缺血性血管生成中發(fā)揮作用進(jìn)行助力，從而為人們治療外周動(dòng)脈疾病在內(nèi)的缺血性疾病提供了新的思路。
  發(fā)表期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：7.919
研究方法：m6A meRIP-seq、RNA-seq、qPCR
文章鏈接：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A
 
研究?jī)?nèi)容
（1）缺氧損害血管生成能力并在CMECs中上調(diào)ALKBH5的表達(dá)
為了闡明m6A在缺血后血管生成中的作用，作者檢測(cè)了缺氧損傷對(duì)CMECs血管生成表型的影響。CCK-8檢測(cè)顯示，CMECs活力在缺氧3 h后升高，12 h達(dá)到峰值，24 h后明顯下降(圖1A)。采用EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖，缺氧24 h后EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低(圖1B和1C)。劃痕和遷移試驗(yàn)顯示缺氧顯著減少了愈合面積(圖1B和1D)和遷移CMECs的數(shù)量(圖1B和1E)且顯著損害了CMECs的血管形成能力(圖1B和1F)。綜上所述，缺氧24 h可抑制CMECs細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。為了確定m6A是否參與了這一過(guò)程，進(jìn)行了點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)m6A的豐度在缺氧的CMECs中顯著降低(圖1G)。RT-qPCR檢測(cè)了甲基化相關(guān)酶在缺氧CMECs中的mRNA表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧損傷后顯著上調(diào)(圖1H)。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)在低氧CMECs中，ALKBH5表達(dá)顯著上調(diào)(圖1I和1J)。
 
（2）ALKBH5過(guò)表達(dá)加重了缺氧誘導(dǎo)的CMECs功能障礙
缺氧誘導(dǎo)的ALKBH5是否參與了血管生成？作者對(duì)ALKBH5過(guò)表達(dá)，并通過(guò)Western blot(圖2A)證實(shí)過(guò)表達(dá)效率。缺氧條件下ALKBH5過(guò)表達(dá)CMECs中m6A豐度降低(圖2B)。EdU和CCK-8測(cè)定結(jié)果表明缺氧條件下ALKBH5過(guò)表達(dá)抑制CMECS增殖(圖2C和2D)和細(xì)胞活力(圖2E)。Scratch和transwell檢測(cè)也顯示，在缺氧條件下過(guò)表達(dá)ALKBH5抑制CMECs的遷移能力(圖2F和2I)。此外，ALKBH5過(guò)表達(dá)在缺氧條件下破壞了血管的形成(圖2J和2K)。這些結(jié)果表明，雖然ALKBH5上調(diào)在常氧條件下可能不會(huì)顯著影響CMECS功能，但在缺氧條件下會(huì)嚴(yán)重加劇CMECS功能障礙，從而導(dǎo)致血管生成受損。
（3）ALKBH5下調(diào)可減輕缺氧誘導(dǎo)的CMECs功能障礙
為了進(jìn)一步研究ALKBH5在血管生成中的作用，作者用siRNA敲除了ALKBH5(圖3A)。斑點(diǎn)雜交實(shí)表明，在常氧和缺氧條件下ALKBH5 KO中m6A整體水平顯著升高(圖3B)。EdU和CCK-8檢測(cè)顯示，在缺氧條件下ALKBH5 KO可以提高CMECs的增殖和活力(圖3C-3E)，增強(qiáng)CMECs的遷移(圖3F-3I)。同樣地，缺氧條件下ALKBH5 KO促進(jìn)CMECs管的形成，而在常氧狀態(tài)下則沒(méi)有(圖3J和3K)。上述數(shù)據(jù)表明，ALKBH5 KO在緩解缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮血管生成損傷中起著關(guān)鍵作用。
（4） MeRIP-seq聯(lián)合RNA-seq揭示了ALKBH5的潛在靶基因
為探討缺氧條件下ALKBH5抑制內(nèi)皮血管生成的機(jī)制，在缺氧條件下轉(zhuǎn)染對(duì)照或ALKBH5 siRNA后，將MeRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合應(yīng)用于CMECs中。MeRIP-seq共發(fā)現(xiàn)12783個(gè)共同峰，對(duì)照組特有477個(gè)峰ALKBH5-KO 有，2358個(gè)特有峰。此外，發(fā)現(xiàn)771個(gè)低甲基化峰和1072個(gè)高甲基化峰(圖4A)。MeRIP-seq進(jìn)一步揭示了差異甲基化mRNA峰的分布特征(圖4B)和百分比(圖4C)�；�于這些數(shù)據(jù)對(duì)兩組CMECs進(jìn)行了motif分析(圖4D)。富集基因的差異表達(dá)分析顯示1352個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，2914個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(圖4E)。結(jié)合MeRIP-seq分析，natriuretic，peptide C 和 FBXW5分別被鑒定為具有代表性的低甲基化和高甲基化基因(圖4F)。GO分析發(fā)現(xiàn)低甲基化基因主要參與細(xì)胞周期和RNA代謝等過(guò)程。而高甲基化基因主要富集在血管生成和細(xì)胞增殖調(diào)控中(圖4G)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ALKBH5 KO誘導(dǎo)m6A高甲基化增強(qiáng)血管生成。POSTAR 、血管生成數(shù)據(jù)庫(kù)、以及MeRIP-seq數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合鑒定了調(diào)控血管生成的ALKBH5靶基因。所得結(jié)果顯示SKP2、WNT5A和FGF18是有待進(jìn)一步研究的潛在促血管生成ALKBH5靶基因(圖4H)。
（5）ALKBH5調(diào)控WNT5A mRNA的穩(wěn)定性和衰減
MeRIP-seq數(shù)據(jù)顯示，ALKBH5敲除后SKP2、WNT5A和FGF18 mRNA的m6A豐度顯著增加(圖5A)。MeRIP-qPCR也對(duì)此結(jié)果進(jìn)行了證實(shí)(圖5B)。為了進(jìn)一步檢測(cè)m6A是否影響目的基因的表達(dá)，RT-qPCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)ALKBH5 KO增加了WNT5A表達(dá)(圖5C, 5D)。RT-qPCR與放線菌素D檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CMECs中WNT5A mRNA的穩(wěn)定性和衰減，結(jié)果顯示添加放線菌素D后，WNT5A的表達(dá)量呈隨時(shí)間下降。然而，與對(duì)照組相比，ALKBH5敲除顯著延遲了WNT5A mRNA的降解，從而延長(zhǎng)了其半衰期(圖5E)。為了進(jìn)一步探討ALKBH5對(duì)WNT5A mRNA的調(diào)控作用，作者評(píng)估了在缺氧CMEC中ALKBH5過(guò)表達(dá)后的WNT5A mRNA表達(dá)和穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ALKBH5顯著降低了WNT5A在蛋白和mRNA水平的表達(dá)(圖5F)，縮短了WNT5A mRNA的半衰期，降低了WNT5A mRNA的穩(wěn)定性(圖5G)。通過(guò)RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ALKBH5與WNT5A mRNA結(jié)合(圖5H)。這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH5通過(guò)去除轉(zhuǎn)錄后m6A修飾，促進(jìn)WNT5A mRNA的衰變并降低其半衰期。是否ALKBH5介導(dǎo)的血管生成依賴于WNT5A？CCK-8和EdU檢測(cè)顯示Foxy-5顯著逆轉(zhuǎn)了ALKBH5過(guò)表達(dá)對(duì)CMECs增殖的抑制作用(圖5I、5J)。此外，F(xiàn)oxy-5顯著消除了過(guò)表達(dá)ALKBH5后對(duì)CMECs遷移的抑制(圖5K)。血管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)Foxy-5恢復(fù)了ALKBH5過(guò)表達(dá)受損的CMECs細(xì)胞的血管形成能力(圖5L）。因此，WNT5A是ALKBH5的靶標(biāo)mRNA。缺氧時(shí)ALKBH5通過(guò)破壞和衰變WNT5A mRNA，從而抑制血管生成能力。
（6）ALKBH5過(guò)表達(dá)減弱缺血損傷后的血流量恢復(fù)和血管生成
為了研究ALKBH5對(duì)缺氧時(shí)體內(nèi)血管生成的影響，在小鼠后肢缺血前4周，通過(guò)在小鼠腓腸肌注射AAV獲得了ALKBH5的持續(xù)過(guò)表達(dá)。在后肢缺血前以及后肢缺血后21天內(nèi)評(píng)估了ALKBH5過(guò)表達(dá)效率、m6A水平、血流速率和血管生成標(biāo)志物的表達(dá)(圖6A)結(jié)果顯示，在注射過(guò)表達(dá)ALKBH5 AAV后，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白(圖6B)顯著上調(diào)。此外，過(guò)表達(dá)ALKBH5后，m6A豐度顯著降低(圖6C)。與對(duì)照組相比，在后肢缺血后第7-21天，過(guò)表達(dá)ALKBH5的小鼠血流恢復(fù)率明顯降低(圖6D和6E)。此外，與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)ALKBH5的小鼠中CD31和α-SMA的表達(dá)水平也顯著下調(diào)(圖6F和6G)，它們分別表明毛細(xì)血管和小動(dòng)脈的密度。因此，過(guò)表達(dá)ALKBH5會(huì)減弱血流恢復(fù)和缺血后血管生成。
（7）ALKBH5基因敲除和腺病毒抑制表達(dá)增加了血管生成，改善了缺血損傷后的血流恢復(fù)
作者采用體外血管萌發(fā)模型和體內(nèi)后肢缺血模型來(lái)驗(yàn)證ALKBH5的血管生成調(diào)節(jié)作用。點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)顯示，在ALKBH5 KO小鼠的主動(dòng)脈環(huán)和腓腸肌組織中，m6A豐度顯著增加(圖7A、7C)。與同窩幼鼠相比，KO小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)勁的血管發(fā)育(圖7B)。同樣的，ALKBH5 KO小鼠后肢缺血后第7-21天血流恢復(fù)明顯增強(qiáng)(圖7 D)。此外，與WT小鼠相比，ALKBH5 KO小鼠腓腸肌中CD31和α-SMA的表達(dá)也顯著上調(diào)(圖7E)。這些結(jié)果表明，ALKBH5 KO對(duì)缺血后血管生成具有保護(hù)作用。作者通過(guò)腺病毒注射WT小鼠腓腸肌對(duì)ALKBH5進(jìn)行了當(dāng)即、后肢缺血7天和14天的短暫下調(diào)(圖7F)。腺病毒注射后1周、2周和3周，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白的表達(dá)均顯著降低(圖7G)。此外，在ALKBH5敲除后，點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)顯示腓腸肌m6A水平在缺血后3周顯著升高(圖7H)。在敲除ALKBH5后，缺血腓腸肌中CD31和-SMA的表達(dá)水平顯著升高(圖7I)。同時(shí)ALKBH5敲除小鼠血流恢復(fù)明顯改善(圖7j)。總之，這些結(jié)果闡明了ALKBH5在缺血后血管生成中的關(guān)鍵作用，并揭示了敲除或抑制ALKBH5表達(dá)的潛在優(yōu)勢(shì)。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步驗(yàn)證以促進(jìn)臨床缺血損傷后的血管生成。
點(diǎn)評(píng)：文章通過(guò)m6A-meRIP-Seq結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（云序提供），通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析確認(rèn)m6A甲基化修飾在缺氧后血管生成中起著重要作用。其中去甲基化酶ALKBH5以依賴于m6A修飾的方式調(diào)控WNT5A的表達(dá)，從而降低其穩(wěn)定性，進(jìn)而阻礙了缺氧CMECs中的血管生成。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明靶向ALKBH5可能成為包括外周動(dòng)脈疾病在內(nèi)的缺血性疾病的潛在治療選擇。為促進(jìn)缺氧損失后血管生成提供新的思路。 云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測(cè)序
m6A RNA修飾測(cè)序（m6A-meRIP-seq）
對(duì)m6A RNA甲基化，目前最流行的檢測(cè)手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測(cè)序：

• m6A 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測(cè)序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測(cè)序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測(cè)序
• m6A  miRNA測(cè)序

02 檢測(cè)整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類修飾水平檢測(cè)，一步到位。
比色法檢測(cè)整體RNA修飾水平
快速檢測(cè)m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。

云序生物服務(wù)優(yōu)勢(shì)
優(yōu)勢(shì)一：發(fā)表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化測(cè)序服務(wù)平臺(tái)。云序已累計(jì)支持客戶發(fā)表47篇高水平文章，合計(jì)影響因子300分+，是國(guó)內(nèi)支持發(fā)文最多、累計(jì)影響因子最高的公司。
優(yōu)勢(shì)二：至今完成4000+例 m6A測(cè)序樣本，全面覆蓋醫(yī)口、農(nóng)口等各類樣本。
優(yōu)勢(shì)三：全面檢測(cè)mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢(shì)四：獨(dú)家提供m6A一站式服務(wù)：m6A整體水平檢測(cè)、m6A測(cè)序、MeRIP-qPCR驗(yàn)證、RIP和RNA pull-down。
優(yōu)勢(shì)五：率先研發(fā)超微量meRIP測(cè)序技術(shù)，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢(shì)六：國(guó)內(nèi)最全的RNA修飾測(cè)序平臺(tái)，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙�；�和2'-O-甲基化測(cè)序。