全球有超過(guò)50000種人類相關(guān)的遺傳疾病，其中大部分是由基因組的點(diǎn)突變引起的。而對(duì)于罕見(jiàn)病而言，80%是由基因缺陷引起的，同時(shí)這些基因缺陷中點(diǎn)突變又占了60%。比如，我們熟悉的鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥就是由于β-globin基因編碼區(qū)上的一個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生突變引起的；又比如多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤（Neurofibromatosis）則是由 Neurofibromin 1/2基因發(fā)生堿基突變引起的。由此可以看出，對(duì)基因組點(diǎn)突變的研究不僅能揭示一些重要的生物學(xué)原理，更有利于人類疾病治療手段的研發(fā)。

 

什么是點(diǎn)突變

點(diǎn)突變是基因突變的一種，廣義的點(diǎn)突變包括所有單個(gè)堿基的改變，即缺失、插入和替換。而狹義的點(diǎn)突變主要指單個(gè)堿基的替換。嘌呤之間和嘧啶之間的替換叫做轉(zhuǎn)換，而嘧啶與嘌呤之間的替換則叫顛換。以上說(shuō)的都是DNA分子層面的改變，如果把視角擴(kuò)展到染色體的層面，則存在染色體數(shù)量改變和染色體結(jié)構(gòu)變異兩種。

圖1. 點(diǎn)突變的方式。

 

點(diǎn)突變對(duì)氨基酸及其構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響分為三種，即同義突變、無(wú)義突變和錯(cuò)義突變。一般情況下，在相同的位點(diǎn)，無(wú)義突變對(duì)蛋白質(zhì)影響最大，錯(cuò)義突變的非保守型突變次之，接下來(lái)是錯(cuò)義突變中的保守型突變，同義突變本身對(duì)蛋白質(zhì)功能無(wú)影響。

圖2. 點(diǎn)突變對(duì)氨基酸的影響。

 

點(diǎn)突變疾病模型的構(gòu)建

研究點(diǎn)突變相關(guān)遺傳疾病，免不了要構(gòu)建細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，而我們?cè)跇?gòu)建細(xì)胞點(diǎn)突變模型時(shí)的理論基礎(chǔ)便是基因的同源重組修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞基因組DNA雙鏈由于外部因素而斷裂時(shí)，細(xì)胞中存在著一種DNA修復(fù)機(jī)制就會(huì)被激發(fā)，對(duì)斷裂位點(diǎn)的DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，根據(jù)修復(fù)方式的不同可分為同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。顧名思義，同源重組是指DNA在修復(fù)的過(guò)程中以同源的DNA序列作為模板完美修復(fù)，而非同源重組修復(fù)是指細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白直接將斷裂的DNA兩端重新連起來(lái)，同時(shí)可能會(huì)隨機(jī)引入新的堿基。

圖3. DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑。A)同源重組修復(fù)，B)非同源重組修復(fù)。

 

根據(jù)這個(gè)理論基礎(chǔ)，點(diǎn)突變細(xì)胞系的構(gòu)建分為三個(gè)部分：

1. 定點(diǎn)切割DNA

由于在自然界中DNA的斷裂是隨機(jī)的，不確定的，因此我們需要人為的定點(diǎn)對(duì)DNA產(chǎn)生切割。在這個(gè)過(guò)程中，CRISPR-Cas9技術(shù)給我們提供了極大的便利。我們可以通過(guò)人為的設(shè)計(jì)sgRNA，并將Cas9蛋白與sgRNA一起轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞中。在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)處的DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。

 

2. 同源重組修復(fù)DNA

我們通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA產(chǎn)生了雙鏈斷裂后，同時(shí)引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制。因此，為了使DNA在修復(fù)過(guò)程中能通過(guò)同源重組的方式修復(fù)DNA并引入突變位點(diǎn)，我們需要為細(xì)胞提供額外的同源修復(fù)模板。這個(gè)模板的本質(zhì)是人為合成的DNA序列，由5’端同源臂、突變位點(diǎn)和3’端同源臂組成。值得注意的是，這種同源模板序列是隨sgRNA和Cas9蛋白一起轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的。

 

3. 陽(yáng)性細(xì)胞篩選

這部分是細(xì)胞模型構(gòu)建的關(guān)鍵部分。試想下，我們通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將CRISPR-Cas9系統(tǒng)和模板DNA序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞中后，由于細(xì)胞內(nèi)部機(jī)制的作用，我們得到的細(xì)胞池中既包含純合子陽(yáng)性細(xì)胞和雜合子細(xì)胞，又包含沒(méi)有發(fā)生堿基突變的野生型細(xì)胞。那么，我們?cè)撊绾翁暨x出目的細(xì)胞將是關(guān)鍵。對(duì)于點(diǎn)突變模型來(lái)說(shuō)，由于沒(méi)有引入抗性基因，常用的方法便是通過(guò)稀釋法將細(xì)胞池細(xì)胞稀釋轉(zhuǎn)移到96孔板中，形成單克隆細(xì)胞。然后收集單克隆細(xì)胞進(jìn)行大量測(cè)序，以得到預(yù)期的純合子細(xì)胞。

 

由于人類疾病中基因產(chǎn)物并非總是如轉(zhuǎn)基因一樣的高表達(dá)，也不是像基因敲除一樣完全不表達(dá)。很多情況下只是由于單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)堿基的改變而造成的蛋白結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為非正常激活或者抑制。因此，構(gòu)建精細(xì)的與疾病對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案。而現(xiàn)在的CRISPR-Cas9技術(shù)也使得我們能夠以更低的成本和功能高的效率將之實(shí)現(xiàn)。賽業(yè)生物基于CRISPR-Cas9技術(shù)自主開(kāi)發(fā)的Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，采取更有效的設(shè)計(jì)方案，高同源重組效率和無(wú)隨機(jī)插入細(xì)胞基因組的風(fēng)險(xiǎn)，適用于多種細(xì)胞，成功率高，經(jīng)大量測(cè)試和優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)工藝，可以更快交付基因敲入和點(diǎn)突變細(xì)胞株，加速您的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展！

現(xiàn)在Smart-CRISPR細(xì)胞基因編輯技術(shù)全新升級(jí)，凡訂購(gòu)點(diǎn)突變、基因敲入細(xì)胞株服務(wù)的客戶均可享優(yōu)惠價(jià)。

 

活動(dòng)時(shí)間：2021年6月10日——2021年7月31日

活動(dòng)對(duì)象：全國(guó)科研終端客戶

 

作為基因改變相關(guān)疾病最主要的誘因，針對(duì)點(diǎn)突變的研究不論是在先天的遺傳疾病還是后天突變導(dǎo)致的腫瘤中都具有重要的意義。除了點(diǎn)突變細(xì)胞模型外，賽業(yè)生物還可以為您提供提供優(yōu)質(zhì)的點(diǎn)突變大小鼠模型，賽業(yè)生物紅鼠庫(kù)通過(guò)對(duì)上千例Crispr項(xiàng)目進(jìn)行深度學(xué)習(xí)，綜合gRNA切割位點(diǎn)、點(diǎn)突變位置、oligo長(zhǎng)度、同義突變個(gè)數(shù)、所在位點(diǎn)Cas9切割效率以及脫靶率等因素，智能化生成gRNA設(shè)計(jì)方案。

 

此外針對(duì)通常條件下，細(xì)胞偏向于使用非同源末端連接的方式對(duì)斷裂的雙鏈進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而造成靶位點(diǎn)基因的插入/缺失突變。賽業(yè)生物團(tuán)隊(duì)在 Crispr/Cas9 技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)新性研發(fā)出 CRISPR-Pro 基因修飾技術(shù)，采用獨(dú)特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復(fù)路徑，進(jìn)而提高同源重組效率。

圖4. 點(diǎn)突變小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)及定制平臺(tái)。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Wu WH, Tsai YT, Justus S, Cho GY, Sengillo JD, Xu Y, Cabral T, Lin CS, Bassuk AG, Mahajan VB, Tsang SH. CRISPR Repair Reveals Causative Mutation in a Preclinical Model of Retinitis Pigmentosa: A Brief Methodology. Methods Mol Biol. 2018;1715:191-205. doi: 10.1007/978-1-4939-7522-8_13. PMID: 29188514.

2. Peng G, Lin SY. Exploiting the homologous recombination DNA repair network for targeted cancer therapy. World J Clin Oncol. 2011 Feb 10;2(2):73-9. doi: 10.5306/wjco.v2.i2.73. PMID: 21603316; PMCID: PMC3095467.