本文節(jié)選自《Gene Therapy Manufacturing Trends》，詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參考原文。
   
基因和基因修飾細(xì)胞療法是生物制藥市場(chǎng)增長(zhǎng)最快的領(lǐng)域之一。這些新藥物即使不能完全治愈曾經(jīng)被認(rèn)為是無(wú)法治愈的疾病，也極有可能緩和這些疾病的影響。已有多家公司在臨床試驗(yàn)和市場(chǎng)上取得了成功，而更多大大小小的開發(fā)商正在吸引大量的投資，旨在加速其產(chǎn)品審批和商業(yè)化進(jìn)程。
 
事實(shí)上，根據(jù)再生醫(yī)學(xué)聯(lián)盟的數(shù)據(jù)，盡管出現(xiàn)了COVID-19大流行，但2020年用于再生藥物和先進(jìn)療法的資金達(dá)到了創(chuàng)紀(jì)錄的199億美元，其中基因療法的資金增長(zhǎng)了73%。在全球范圍內(nèi)活躍的、基于組織的治療方法進(jìn)行了超過(guò)1,200項(xiàng)臨床試驗(yàn)(比前一年多約100項(xiàng))，其中31.5%處于I期，56%處于II期，12.5%處于III期。
 
另外，有兩項(xiàng)基因療法在2020年獲得批準(zhǔn)：Orchard Therapeutics的基因療法Libmeldy獲得了歐洲藥品管理局(EMA)的批準(zhǔn)，Kite Pharma的嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)療法獲得了美國(guó)食品藥品管理局(FDA)的批準(zhǔn)。預(yù)計(jì)2021年將針對(duì)8種新的再生藥物產(chǎn)品作出8項(xiàng)額外的監(jiān)管決定。
 
早在2019年，F(xiàn)DA就曾預(yù)計(jì)，其每年將收到超過(guò)200個(gè)細(xì)胞和基因療法的研究性新藥申請(qǐng)，到2025年，每年將有10到20個(gè)細(xì)胞和基因療法產(chǎn)品獲得批準(zhǔn)。



 
工藝即產(chǎn)品
 
然而，監(jiān)管部門正在密切關(guān)注基因和細(xì)胞治療的生產(chǎn)，因?yàn)檎�如人們�?jīng)常指出的那樣，“工藝即產(chǎn)品”�；�因和基因修飾細(xì)胞療法是利用病毒載體生產(chǎn)的。對(duì)于基因療法來(lái)說(shuō)，載體就是療法，作為目的基因的傳遞工具，前者將用于取代缺失或功能失調(diào)的基因。在基因修飾細(xì)胞治療中，例如CAR- T細(xì)胞治療，病毒載體被用來(lái)將遺傳物質(zhì)遞送到細(xì)胞中，以某種方式對(duì)其進(jìn)行改造，從而增強(qiáng)或提高生物活性。
 
最常用的病毒載體是腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(LV)，但腺病毒和一些逆轉(zhuǎn)錄病毒也被用于基因和基因修飾細(xì)胞治療候選療法臨床管線。
 
這些病毒載體是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的，通常是用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(典型為HEK293)，但在某些情況下(如AAV)是通過(guò)同時(shí)感染桿狀病毒昆蟲細(xì)胞體系，或使用人類來(lái)源的單純皰疹病毒(HSV) 1型系統(tǒng)。
 
更穩(wěn)定的包裝和生產(chǎn)細(xì)胞系已經(jīng)開發(fā)并在某些情況下使用，但這些解決方案需要更長(zhǎng)的開發(fā)時(shí)間，需要顯著的更多優(yōu)化工作，才能被更高廣泛地使用。
 
對(duì)于基因療法來(lái)說(shuō)，需要最大限度地縮短進(jìn)入臨床試驗(yàn)的時(shí)間，而更重要的是縮短進(jìn)入市場(chǎng)的時(shí)間，因?yàn)榈谝粋�(gè)推出的產(chǎn)品將主導(dǎo)市場(chǎng)；與單克隆抗體不同的是，后來(lái)者獲得市場(chǎng)份額的機(jī)會(huì)更低。
 
因此，最初的重點(diǎn)是展示藥物療效，而不是工藝效率、穩(wěn)健性和可放大性。事實(shí)上，許多最初在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上通過(guò)靜態(tài)塑料器皿開發(fā)的基因治療方法，足以用于發(fā)現(xiàn)工作，甚至用于早期臨床試驗(yàn)物料的生產(chǎn)。然而，它們通常需要大量的手動(dòng)操作，不適合大規(guī)模使用。



 
最初專注于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)
 
大多數(shù)基因療法，包括今天正在發(fā)展當(dāng)中的那些，開始使用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝，盡管對(duì)于臨床前階段來(lái)說(shuō)，貼壁細(xì)胞復(fù)雜且昂貴，但其提供了一種快速發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和進(jìn)入臨床的手段。
 
然而，重組蛋白和單克隆抗體(mAb)的傳統(tǒng)生物制造工藝是在攪拌罐反應(yīng)器(STR)的懸浮進(jìn)行的。這些反應(yīng)器最初被開發(fā)用于化學(xué)工業(yè)，然后被用于釀造，最后被用于生物制品的生產(chǎn)。對(duì)于mAb，其提供了許多優(yōu)點(diǎn)，包括可放大性以及眾所周知的流體動(dòng)力學(xué)行為，這允許實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制和高水平的再現(xiàn)性。在過(guò)去的幾十年里，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)良好，提供了穩(wěn)健且高產(chǎn)的細(xì)胞系，能夠產(chǎn)生比初始細(xì)胞系顯著更高的滴度。
 
用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝的STR越來(lái)越多地使用一次性使用系統(tǒng)，且其可以很容易地實(shí)現(xiàn)從mL到6,000 L或更大的規(guī)模。接種液首先在搖瓶中制備，然后在較小的生物反應(yīng)器中以10倍每步的步驟提高接種液的體積，直到獲得所需的接種量。



 
攪拌罐生物反應(yīng)器的局限性
 
然而，STR懸浮細(xì)胞培養(yǎng)在病毒載體生產(chǎn)方面存在局限性。任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)都需要適當(dāng)?shù)臐舛�，以便通過(guò)分泌和吸收各種輔助因子使細(xì)胞之間能夠“交流”。由于STR中的濃度效應(yīng)，生產(chǎn)性生物反應(yīng)器必須在高濃度下接種 - 比最初的貼壁工藝要高得多 – 這會(huì)帶來(lái)額外的時(shí)間和成本。
 
懸浮細(xì)胞是由貼壁細(xì)胞“改造”而來(lái)的。由于它們不是在它們的自然狀態(tài)，它們的行為方式不同，而且往往比它們的貼壁“同行”提供更低的產(chǎn)量。HEK293細(xì)胞適應(yīng)懸液的工作只進(jìn)行了幾年，而不是幾十年，因此，它們?cè)诖笠?guī)模生產(chǎn)時(shí)往往不那么“健壯”，因此在規(guī)模放大方面仍然存在許多挑戰(zhàn)。
 
用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞需要均勻混合才能有效，但在大型STR內(nèi)實(shí)現(xiàn)均勻混合是困難的，因?yàn)榛旌闲�率隨規(guī)模擴(kuò)大而降低。攪拌和氣體流動(dòng)速率(氧氣鼓泡，導(dǎo)致大的、分散氣泡的存在)必須非線性地增加，以計(jì)入罐總體積 (m3) 與可用于熱和氣體傳輸?shù)谋砻?m2)之比的增加。更高的攪拌意味著更高的機(jī)械力和更高的局部氧化應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)。
 
用于病毒載體生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)這些在大型STR中普遍存在的剪切和氧化應(yīng)激敏感。剪切應(yīng)力也會(huì)破壞質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒DNA-轉(zhuǎn)染劑復(fù)合物，從而在泵送和實(shí)際工藝中需要注意。
 
剪切應(yīng)力和氧化應(yīng)激都對(duì)會(huì)這一過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響。這通常需要更多的開發(fā)工作來(lái)將懸浮病毒載體工藝從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到中試工廠，再轉(zhuǎn)移到商業(yè)化生產(chǎn)，而產(chǎn)量通常還仍不是最優(yōu)的。
 
此外，典型的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模轉(zhuǎn)染工藝需要重復(fù)清洗轉(zhuǎn)染混合物。這在STR的大規(guī)模懸浮工藝中是不可行的，因?yàn)樗鼘⑿枰�處理成百上千升的液體。為了避免這個(gè)問(wèn)題，要么通過(guò)過(guò)濾方法濃縮細(xì)胞，要么不清洗直接將轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)中 - 這兩種方法都會(huì)增加時(shí)間和成本。
 
行業(yè)對(duì)使用灌流細(xì)胞培養(yǎng)作為維持更長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、而達(dá)到更高產(chǎn)量的手段的興趣正在增加。在STR中，灌流需要使用外部細(xì)胞截留裝置，但需要選擇低剪切的技術(shù)，以降低對(duì)細(xì)胞的應(yīng)激。（相關(guān)閱讀：灌流中，ATF平均剪切低于TFF：低剪切提高重組蛋白生產(chǎn)，高剪切增加細(xì)胞凋亡）
 



固定床生物反應(yīng)器中的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)
 
在固定床反應(yīng)器(FBR)中進(jìn)行的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)提供了一種替代在STR中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的方式。固定在“床”上的細(xì)胞與液體培養(yǎng)基“分離”，允許在不影響細(xì)胞的情況下優(yōu)化工藝參數(shù)。具體來(lái)說(shuō)，F(xiàn)BR包含一個(gè)固體但可滲透的支持基質(zhì)，促進(jìn)貼壁細(xì)胞的均勻分布，并在最小的機(jī)械或氧化應(yīng)力下，溫和循環(huán)或灌流培養(yǎng)基，促使FBR獲得更高的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力。
 
與STR相比，固定床的設(shè)計(jì)支持幾乎相同的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)量，而體積減少了100倍。更小的體積意味著更緊湊的占地面積，50 L FBR的產(chǎn)量相當(dāng)于1,000 L或更大的STR。
 
FBR中更高的細(xì)胞密度也大大減少了所需的接種數(shù)量，從而降低了種子生產(chǎn)的操作負(fù)擔(dān)。由于細(xì)胞被“床”自然截留，F(xiàn)BR也可實(shí)現(xiàn)灌流工藝，因?yàn)椴恍枰獜?fù)雜的細(xì)胞截留裝置，這降低了工藝的復(fù)雜性和成本，同時(shí)也降低了細(xì)胞暴露于剪切應(yīng)激的可能性。
 
此外，罐體積與氣體和熱交換表面的比例在規(guī)模放大或縮小時(shí)變化不大，即更容易維持罐內(nèi)的均勻狀態(tài)。這一特性也簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)染過(guò)程，可以直接從小規(guī)模轉(zhuǎn)移到大規(guī)模，而不需要細(xì)胞濃縮、稀釋或重新開發(fā)轉(zhuǎn)染混合物。
 
FBR的這一特性可方便利用一次性使用技術(shù)以及高水平的自動(dòng)化和控制，實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)規(guī)模的線性可放大性，從而在降低風(fēng)險(xiǎn)的情況下實(shí)現(xiàn)更快速的開發(fā)和商業(yè)化。
 
值得注意的是，在貼壁FBR工藝中，接種液的制備首先是在扁平培養(yǎng)容器中進(jìn)行，然后在多層培養(yǎng)容器中放大。當(dāng)產(chǎn)量足夠多時(shí)，細(xì)胞酶解分離，以接種FBR。為了促進(jìn)細(xì)胞在整個(gè)固定床上的均勻分布，必須確保細(xì)胞作為單個(gè)單元存在。如果剪切敏感型病毒載體為胞外生產(chǎn)，應(yīng)特別小心，因其生產(chǎn)后將在FBR中循環(huán)。



 
FBR在載體制造中的應(yīng)用
 
Univercells Technologies開發(fā)了scale-X FBR產(chǎn)品組合，以方便現(xiàn)有貼壁工藝的轉(zhuǎn)移和縮放。scale-X hydro (2.4 m2)、scale-X carbo(10-30 m2)和scale-X nitro(200-600 m2)分別支持基因和基因修飾細(xì)胞療法的工藝開發(fā)、中試規(guī)模、中 - 大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。scale-X生物反應(yīng)器產(chǎn)品也被證明適用于基于懸浮的工藝。在這種情況下，懸浮細(xì)胞被捕獲在固定床中，從而可以在不影響工藝質(zhì)量或生產(chǎn)率的情況下，從基于懸浮的工藝直接轉(zhuǎn)移到scale-X FBR。
 
這種設(shè)計(jì)的結(jié)果是在與靜態(tài)塑料器皿類似的條件下，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基在細(xì)胞間的溫和循環(huán)。一個(gè)緊密排列的支撐矩陣由卷式無(wú)紡布聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)織物層組成，允許在小占地的生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度。磁性離心葉輪可提供良好混合，以確保整個(gè)固定床中營(yíng)養(yǎng)物的可用性，系統(tǒng)通過(guò)罐頂部空間的“降膜”通氣，以提高可用于氣體交換的表面積，并在垂直和水平兩個(gè)方向?qū)崿F(xiàn)一致的環(huán)境。
 
液體培養(yǎng)基通過(guò)固定床的線速度在不同規(guī)模上保持不變，因此，細(xì)胞經(jīng)歷類似的低剪切條件。自動(dòng)化程度高的同時(shí)，保證了關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制。



 
滿足大規(guī)模病毒載體制造需求
 
攪拌罐生物反應(yīng)器的基本力學(xué)和操作約束可能導(dǎo)致工藝開發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，并影響生產(chǎn)率、效率和成本。雖然懸浮細(xì)胞培養(yǎng)被廣泛用于生產(chǎn)病毒載體，但要實(shí)現(xiàn)真正的工業(yè)化，還需要更可靠、可放大的解決方案。隨著貼壁工藝和懸浮工藝的不斷進(jìn)步，支持這兩種方法的平臺(tái)將通過(guò)分離工藝和技術(shù)來(lái)優(yōu)化生產(chǎn)率和響應(yīng)時(shí)間。
 
固定床生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)為大規(guī)模生產(chǎn)病毒載體提供了解決方案，并將在促進(jìn)大量低成本基因和基因修飾細(xì)胞療法的制造方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用scale-X FBR，早期開發(fā)工藝可以使用更簡(jiǎn)單的流程，直接轉(zhuǎn)移到占地面積更小的一次性使用設(shè)備中，并獲得更高的生產(chǎn)率和產(chǎn)量。
 
此外，最近正在進(jìn)行的關(guān)于scale-X FBR在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中用于病毒載體制造的適用性的研究表明，這種一次性使用生物反應(yīng)器技術(shù)也為利用懸浮工藝的基因治療開發(fā)商提供了好處。具體數(shù)據(jù)將很快公布。
 
原文：A.Chatel, Gene Therapy Manufacturing Trends. Contract Pharma, 2021.
   
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