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基因基本信息

備注：標(biāo)有√的意為賽業(yè)紅鼠資源庫有該種保存狀態(tài)的小鼠

 

CD39的功能簡介

CD39，也稱為膜外三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1），由ENTPD1基因編碼而成。CD39是一個跨膜蛋白，具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞外結(jié)構(gòu)域。CD39的活性中心在胞外結(jié)構(gòu)域上，但有研究表明兩個跨膜結(jié)構(gòu)域之間的互相作用也會影響酶活性[1]。功能上，CD39能與胞外ATP（extracellular ATP，eATP）結(jié)合，并將其水解為AMP；另一種胞外核酸酶CD73則會將AMP水解為腺苷（adenosine，ADO）。在ATP-ADO通路中，CD39是eATP水解的限速酶，而CD39是AMP水解的限速酶（圖1）。此外，CD39也能將水解ADP，但效率較低[3]。

圖1. TME中的ATP-ADO通路[2]。

在腫瘤微環(huán)境（tumour microenvironment，TME）中，累積的eATP能通過P2嘌呤受體 (P2XRs和P2YRs) 刺激細(xì)胞炎癥反應(yīng)，或通過胞外核苷酸酶CD39和CD73被降解為免疫抑制性的ADO。在缺氧的TME中，CD39和CD73在多種細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，且表達(dá)量上調(diào)。在特定組織或腫瘤類型中，ADO也能通過其它途徑產(chǎn)生，例如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）介導(dǎo)的ATP分解，或由CD38、CD203a 和CD73對NAD+進(jìn)行順序分解代謝產(chǎn)生。此外，高濃度的胞外ADO能通過腺苷受體(A2A、A2B等）促進(jìn)TME中的免疫抑制性微環(huán)境，且胞外ADO濃度由腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）調(diào)控，ADA能將ADO轉(zhuǎn)化為肌苷。

 

CD39的表達(dá)

CD39在多種免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞（e.g., 內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）中均有表達(dá)，且CD39和其下游的ADO受體在受到包括組織損傷、缺氧和組織重塑等多種刺激下，也會上調(diào)表達(dá)水平。此外，腫瘤細(xì)胞也進(jìn)化出了通過上調(diào)CD39表達(dá)量來消耗具有免疫激活作用的eATP的免疫逃逸機(jī)制。在淋巴瘤、肉瘤、肺癌等多種腫瘤中，研究人員都觀測到了CD39表達(dá)水平升高。在腫瘤微環(huán)境（tumour microenvironment，TME）中，血管內(nèi)皮細(xì)胞和一些免疫細(xì)胞亞群也會高表達(dá)CD39，例如NK細(xì)胞、CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg)、巨噬細(xì)胞等。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞上CD39的表達(dá)在血管生成（angiogenesis）和原代腫瘤生長中都扮演了重要角色[4]。

 

eATP和ADO在TME中的作用

eATP和ADO已被證明在TME中分別有促炎作用和免疫抑制作用[5]。在TME中，它們間的平衡調(diào)控著多種細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)（圖2）。CD73拮抗劑或A2ARi都只注重逆轉(zhuǎn)ADO的免疫抑制作用，而低估了eATP在其中起到的功效；靶向CD39的療法則有從多方面調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng)的潛力[2]。

圖2. TME中ATP與ADO的“陰”與“陽”[2]。

TME中，eATP與胞外ADO一起調(diào)控多種細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)：促炎（pro-inflammation）或促腫瘤生長（pro-tumor）。eATP通過嘌呤受體在多種細(xì)胞類型中發(fā)揮免疫激活作用；而ADO通過ADO受體介導(dǎo)的多種機(jī)制在同樣的細(xì)胞中抑制免疫反應(yīng)。

 

CD39抑制劑的抗腫瘤免疫機(jī)制

理論上，在ATP-ADO通路中抑制CD39具有雙重抗腫瘤免疫效果：①通過抑制ATP的水解，提高TME中有促炎和促細(xì)胞增殖作用的ATP水平；②通過抑制下游產(chǎn)物ADO的累積，逆轉(zhuǎn)ADO受體直接介導(dǎo)的免疫抑制作用及長期建立的免疫抑制性TME[2]。此外，還有研究人員發(fā)現(xiàn)了一些其他的機(jī)制（圖3）。

圖3. 在TME中治療性抑制CD39胞外核苷酸酶活性能通過多種機(jī)制提升抗腫瘤免疫效果[2]。

（a）TME中的多種細(xì)胞表達(dá)CD39，從而促進(jìn)胞外核苷酸酶介導(dǎo)的eATP分解代謝，包括CD4+ CD25+ Treg、耗竭T細(xì)胞、髓系來源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。由于缺氧，細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的eATP持續(xù)釋放，以及通過抑制CD39來抑制ATP降解，都會導(dǎo)致TME中eATP含量的增加。

（b）除了提高eATP的累積量以外，抑制CD39的酶活性也會減少ADO的累積量，從而降低各種駐留和浸潤免疫細(xì)胞的免疫抑制作用，例如表達(dá)A2A和/或A2B受體的NK細(xì)胞和T細(xì)胞。

（c）eATP水平上調(diào)能激活髓系細(xì)胞中的P2X7，促進(jìn)炎癥小體（inflammasome）介導(dǎo)的包括IL18和IL-1β在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的釋放，從而支持效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。eATP水平上調(diào)也能誘導(dǎo)P2X7+ 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡（pyroptosis）。

（d）此外，eATP與DCs上的P2X7結(jié)合能增強(qiáng)抗原呈遞作用，并促進(jìn)DC的成熟，進(jìn)一步支持抗腫瘤免疫作用。

 

靶向CD39的聯(lián)合免疫療法

除了單藥免疫療法，利用療效“1+1>2”的聯(lián)合免疫療法也越來越火熱。目前，也有多種靶向CD39的聯(lián)合免疫療法處于實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)階段（圖4）。

圖4. 靶向CD39的聯(lián)合免疫療法[2]。

（a）同時阻斷CD39和其他ATP-ADO通路中的蛋白（CD73, A2A/A2B受體和CD38）可以通過①提高具有免疫激活作用的eATP水平、②抑制具有免疫抑制作用ADO的生成，來提高治療效果。此外，阻斷ATP-ADO通路中的多種蛋白能降低可能存在的代償機(jī)制的影響，以及降低靶向單一蛋白可能無法完全阻斷該通路的風(fēng)險。

（b）同時阻斷CD39和其他免疫檢查點(diǎn)（例如PD-1、PD-L1和CTLA-4等）在臨床前模型中顯示出了聯(lián)合抗腫瘤療效。此外，在一些靶細(xì)胞中，CD39與免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)。例如，在耗竭T細(xì)胞中，CD39與PD-1共表達(dá)；在巨噬細(xì)胞中，CD39與PD-L1共表達(dá)。

（c）由化療或放療引起的腫瘤細(xì)胞死亡會增加eATP和腫瘤抗原的釋放，而同時進(jìn)行CD39阻斷能維持TME中eATP 的高含量，提高DCs的抗原呈遞效果，增強(qiáng)抗腫瘤免疫作用。

（d）過繼性細(xì)胞療法（例如CAR-T）的抗腫瘤效果可能會被適應(yīng)性耐藥機(jī)制所限制，包括CD39的上調(diào)或形成低eATP/高ADO的TME。靶向CD39、CD73和/或PD-1能減弱這種耐藥機(jī)制，提高抗腫瘤免疫效果。

（e）降低胞外ADO水平也能提高表達(dá)Fc受體的效應(yīng)細(xì)胞的效應(yīng)作用。降低對巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的抑制作用可以分別提高腫瘤抗原介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)。

 

小結(jié)

靶向TME中的ATP-ADO通路是一種非常有前景的療法。而其中，CD39抑制劑在TME中具有雙重抗腫瘤免疫效果：①提高具有免疫激活性的eATP水平；②減少具有免疫抑制性的ADO累積。目前，多種CD39抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段：例如，由Innate Pharma/Astrazeneca公司研發(fā)的IPH5201、由Tizona Therapeutics公司研發(fā)的TTX-030和由Surface Oncology公司研發(fā)的SRF617。此外，由科望醫(yī)藥(Elpiscience) 研發(fā)的ES002、由Secarna公司研發(fā)的靶向CD39的反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）等也正處于臨床前研究階段。

 

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CD39人源化小鼠助力腫瘤研究

品系背景：C57BL/6N、BALB/c

 

品系構(gòu)建策略：

在小鼠CD39基因位點(diǎn)敲入人源CD39胞外域序列，保留小鼠胞內(nèi)域和跨膜域，構(gòu)建嵌合型CD39人源化小鼠模型。

 

品系說明：

■ CD39在小鼠體內(nèi)具有正常的生理表達(dá)和調(diào)節(jié)模式。

■ CD39胞外域人源化，利于hCD39靶向藥物的識別。

■ 保留小鼠CD39胞內(nèi)域，保證正常的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

■ 小鼠靶基因不表達(dá)，避免交叉反應(yīng)。

■ 小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。

 

研究應(yīng)用：

本模型可用于評估hCD39靶向藥物在免疫健全小鼠體內(nèi)的有效性及安全性。

 

模型驗(yàn)證：

CD39表達(dá)檢測

圖1. hCD39在hCD39小鼠中的表達(dá)模式與mCD39在野生型小鼠中的表達(dá)模式一致。

hCD39和mCD39在新鮮分離的脾細(xì)胞中的表達(dá)情況：（A）樹突狀細(xì)胞（CD3- CD19- CD11b+ CD11c+）、（B）B細(xì)胞（CD3- CD19+）和（C）Tregs（viable, CD3+ CD4+ CD25+ Foxp3+）。

 

CD39功能檢測

圖2. hCD39是有功效的：αhCD39抗體能特異性降低hCD39的活性。

用αmCD39抗體、αhCD39抗體或作為對照組的ARL（胞外核苷酸酶抑制劑）對（A）野生型小鼠和（B）hCD39小鼠新鮮分離的脾細(xì)胞處理1h。加入ATP后，通過CellTiter-Glo®發(fā)光細(xì)胞測定法測量ATP水平。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Grinthal, A., Guidotti, G. CD39, NTPDase 1, is attached to the plasma membrane by two transmembrane domains. Why? Purinergic Signal 2, 391-8(2006).

[2] Moesta, A.K., Li, XY. & Smyth, M.J. Targeting CD39 in cancer. Nat Rev Immunol 20, 739–755 (2020).

[3] Antonioli, L., Pacher, P., & Vizi, E. S., et al. CD39 and CD73 in immunity and inflammation. Trends in molecular medicine, 19(6), 355–367(2013).

[4] Jackson, S.W., Hoshi, T. & Wu Y., et al. Disordered purinergic signaling inhibits pathological angiogenesis in cd39/Entpd1-null mice. The American journal of pathology 171, 1395–1404(2007).

[5] Stagg, J., Smyth, M. Extracellular adenosine triphosphate and adenosine in cancer. Oncogene 29, 5346–5358 (2010).