英國制藥巨頭阿斯利康（AstraZeneca）公司在genOway的PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠（賽業(yè)生物已與genOway達(dá)成戰(zhàn)略合作伙伴關(guān)系并引進(jìn)該小鼠）上測(cè)試了一款新型的同時(shí)靶向PD-1和CTLA-4的單價(jià)雙特異性抗體MEDI5752，研究結(jié)果發(fā)表在了Cancer Discovery上。

 

背景

免疫檢查點(diǎn)療法是近來腫瘤治療的熱門領(lǐng)域，其中，靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制劑都已獲批上市，并取得了顯著成果。此外，PD-1和CTLA-4抑制劑的聯(lián)用也在包括黑色素瘤、腎癌、非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中表現(xiàn)出了顯著增強(qiáng)的抗腫瘤效果。但其中，CTLA-4抑制劑的免疫相關(guān)不良事件（(immune-relatedadverse events，irAEs）也一直是個(gè)令人頭疼的問題，包括常見的胃腸道毒性、皮膚毒性和肝臟毒性等。為了解決這個(gè)問題，AstraZeneca公司研發(fā)了一款同時(shí)靶向PD-1和CTLA-4的單價(jià)雙特異性抗體MEDI5752。MEDI5752是一種能優(yōu)先抑制PD-1+ T細(xì)胞上CTLA-4的新型免疫抑制劑。

 

與傳統(tǒng)的PD-1/CTLA-4雙抗不同，MEDI5752能引發(fā)對(duì)PD-1的快速內(nèi)化和降解，并能優(yōu)先定位和聚積在腫瘤部位。MEDI5752目前正處于phase I 階段(NCT03530397)，并在兩名晚期實(shí)體瘤患者中觀測(cè)到了部分緩解（partial response, PR）。

 

此外，值得一提的是，AstraZeneca有一款最早由輝瑞 （Pfizer）公司研發(fā)是anti-CTLA-4全人源化單克隆抗體Tremelimumab。但由于Tremelimumab在臨床試驗(yàn)中一直表現(xiàn)不佳，直至目前為止，還沒有獲批治療任何癌癥。AstraZeneca也在嘗試將Tremelimumab與其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物聯(lián)用，例如，Tremelimumab與Imfinzi（anti-PD-L1）聯(lián)用來治療非小細(xì)胞肺癌（III期NEPTUNE試驗(yàn)失敗）、晚期膀胱癌（III期DANUBE試驗(yàn)失�。�、肝細(xì)胞癌（III期HIMALAYA試驗(yàn)進(jìn)行中）等癌癥。AstraZeneca將Tremelimumab和一個(gè)anti-PD-1 mAb進(jìn)行組合與改造，構(gòu)建了MEDI5752。

 

CTLA-4在多種實(shí)體瘤TILs中的PD-1+ T細(xì)胞上表達(dá)富集

研究人員分析了來自4種腫瘤的44個(gè)腫瘤樣本：結(jié)直腸癌（CRC）、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、腎細(xì)胞癌（RCC）和黑色素瘤（Melanoma），發(fā)現(xiàn)在所有類型的腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)PD-1+ CTLA-4+ 的CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞，并且CTLA-4的表達(dá)在PD-1+ T細(xì)胞上富集。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，腫瘤反應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞的標(biāo)志物CD39在PD-1+ CTLA-4+ 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞 (Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)上表達(dá)富集。在隨后對(duì)183例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN），NSCLC和尿路上皮細(xì)胞癌（UCC）樣本進(jìn)行的影像融合（co-registration）分析顯示，80% SCCHN、84% 鱗狀細(xì)胞NSCLC（NSCLC-Sq）、89%腺癌NSCLC（NSCLC-Ad）和 90% 尿路上皮癌（UCC）中都存在PD-1+ CTLA-4+ TILs。

 

MEDI575的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與特征

AstraZeneca將anti-CTLA-4的Tremelimumab和一個(gè)anti-PD-1 mAb進(jìn)行組合，構(gòu)成了MEDI5752的基本結(jié)構(gòu)。MEDI5752中人gamma-1重鏈恒定區(qū)也進(jìn)行了改造（L234F、L235E和P331S）以降低Fc介導(dǎo)的免疫效應(yīng)功能。此外，與親本抗體一致，MEDI5752只對(duì)小鼠PD-1有低親和力，而和小鼠CTLA-4無交叉反應(yīng)。

圖1. MEDI575的結(jié)構(gòu)示意圖[1]

 

效價(jià)對(duì)PD-1的抑制作用影響很小，而對(duì)CTLA-4影響較大

研究人員使用了雙細(xì)胞熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（two-cell luciferase reporter assay）和PBMC實(shí)驗(yàn)來研究抗體效價(jià)（valence）對(duì)PD-1和CTLA-4抑制作用的影響。雙細(xì)胞熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與二價(jià)anti-PD-1 mAb相比，單價(jià)anti-PD-1抗體MEDI5752或mvPD-1的半最大效應(yīng)濃度（EC50）分別升高了3.5倍和3.8倍（圖2A-B）；與二價(jià)anti-CTLA-4 mAb相比，單價(jià)anti-CTLA-4抗體MEDI5752或mvCTLA-4的EC50則分別升高了14.9倍and 13.3倍（圖2C-D）。

 

在PBMC實(shí)驗(yàn)中，研究人員也觀察到了類似的現(xiàn)象。mvPD-1誘導(dǎo)PBMC增加2倍IL2分泌量的最低有效濃度（MEC）只比anti-PD-1 mAb高1.14倍；而mvCTLA-4的MEC則比anti-CTLA-4 mAb高8.1倍。這些結(jié)果說明valence對(duì)PD-1的抑制作用影響很小，而對(duì)CTLA-4的抑制作用影響較大，因此，MEDI5752與CTLA-4的結(jié)合能力在PD-1− T細(xì)胞上可能會(huì)顯著下降。

圖2. 單價(jià)（Monovalent）降低了MEDI5752對(duì)CTLA-4的效力，但對(duì)PD-1的抑制作用影響很小[1]

 

MEDI5752能優(yōu)先抑制PD-1+ 細(xì)胞上的CTLA-4

在靶向兩個(gè)不同的細(xì)胞表面受體的雙抗中，雙抗會(huì)傾向優(yōu)先與表達(dá)密度高的受體結(jié)合。因此，雙抗與表達(dá)密度高的受體的結(jié)合率將只取決于對(duì)應(yīng)單價(jià)臂對(duì)該受體的內(nèi)在親和力，而第二個(gè)單價(jià)臂與表達(dá)密度低的受體的結(jié)合則會(huì)被限制在一個(gè)相當(dāng)于抗體長度的半徑范圍中。在這個(gè)范圍里，第二個(gè)單價(jià)臂對(duì)表達(dá)密度低的受體的結(jié)合力明顯增強(qiáng)，研究人員將這個(gè)現(xiàn)象稱為“cooperative binding”（圖3A）。已知在PD-1+ CTLA-4+ 雙陽性T細(xì)胞中，PD-1在細(xì)胞膜上的表達(dá)密度比CTLA-4高，因此，MEDI5752會(huì)優(yōu)先與PD-1結(jié)合。并且，與只表達(dá)CTLA-4的PD-1- CTLA-4+ CHO細(xì)胞相比，MEDI5752會(huì)優(yōu)先靶向和飽和PD-1+ CTLA-4+ CHO細(xì)胞上的CTLA-4（圖3B）。

 

為了探究“cooperative binding”的效應(yīng)，研究人員在活化的人PBMC中加入（block）或不加入（no block）飽和濃度的PD-1抗體進(jìn)行處理。在block組，MEDI5752只會(huì)與CTLA4結(jié)合；在no block組，MEDI5752能發(fā)揮“cooperative binding”效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“cooperative binding”效應(yīng)顯著降低了誘導(dǎo)PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI5752濃度（93.55倍） (圖3C)。這些結(jié)果說明MEDI5752 能優(yōu)先抑制PD-1+細(xì)胞上的CTLA-4。

圖3. 與PD-1- CTLA-4+ 單陽性細(xì)胞相比，MEDI575優(yōu)先與PD-1+ CTLA-4+ 雙陽性細(xì)胞上的CTLA-4結(jié)合[1]

 

MEDI5752介導(dǎo)了PD-1的內(nèi)化和降解

有報(bào)道顯示，細(xì)胞膜表面80%的CTLA-4會(huì)在5分鐘內(nèi)被快速內(nèi)化（internalization），因此在任意時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞膜表面都只會(huì)有少量的CTLA-4存在。研究人員探究了MEDI575及其親本抗體在PD-1+ CTLA-4+ CHO細(xì)胞、人原代CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞中的內(nèi)化能力。結(jié)果顯示MEDI5752和只靶向CTLA-4的抗體（anti-CTLA4 mAb和mvCTLA4）都能被快速內(nèi)化，而只靶向PD-1的抗體（anti-PD-1 mAb和mvPD-1）的內(nèi)化程度非常低（圖4A）。

 

為探究內(nèi)化后PD-1和CTLA4的去向，研究人員使用了帶有熒光標(biāo)記的PD-1+ SNAP-tag/CTLA4+ CLIP-tag雙陽性CHO細(xì)胞來進(jìn)行追蹤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有同時(shí)靶向PD-1和CTLA-4的MEDI575能顯著增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞膜表面PD-1的降解；此外，與加入Buffer的空白對(duì)照組對(duì)比，加入靶向PD-1或CTLA-4抗體并沒有顯著改變CTLA4的內(nèi)化（圖4B）。這些結(jié)果說明MEDI5752通過與CTLA-4結(jié)合，介導(dǎo)了PD-1的內(nèi)化和降解。

圖4. MEDI575介導(dǎo)了PD-1的內(nèi)化和降解[1]

 

與單抗組合相比，MEDI5752優(yōu)先靶向雙陽性細(xì)胞上的CTLA-4

與單抗組合（anti-CTLA4 mAb和anti–PD-1 mAb）相比，MEDI5752能以低10倍和250倍的濃度分別使PD-1+ CTLA-4+（10:1）CHO細(xì)胞和PD-1+ CTLA-4+（40:1）CHO細(xì)胞上的CTLA-4飽和（圖5A-B）。此外，MEDI5752飽和PD-1的能力與單抗組合相比沒有明顯區(qū)別（圖5B）。接下來，研究人員再次在活化PBMC上探究了MEDI5752 的“cooperative binding”效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單抗組合（anti-PD-1 mAb/anti-CTLA4 mAb 或anti-PD-1 mAb/mvCTLA4 mAb）相比，MEDI5752 的“cooperative binding”效應(yīng)顯著降低了誘導(dǎo)PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI5752濃度（42.33倍和96.35倍）（圖5C-D）。這些結(jié)果說明與單抗組合相比，MEDI5752有更強(qiáng)的功效。

 

由于CTLA-4能通過在Treg上的表達(dá)來內(nèi)在地和外在地調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，研究人員將原代Treg與同種異體（allogeneic）的CD3+ T細(xì)胞，以及清除了CD3+ 細(xì)胞的PBMC共培養(yǎng)，來模擬相關(guān)共刺激分子存在時(shí)，淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單抗組合能克服Treg介導(dǎo)的對(duì)Teff的抑制作用，且與單抗組合相比，在Treg:Teff比例為1:4和1:8時(shí)，MEDI5752能使IFNγ的分泌量顯著增加（圖5E-G）。這些結(jié)果說明與單抗組合相比，MEDI5752在T細(xì)胞活化和克服Treg介導(dǎo)的抑制作用時(shí)有更高的活性。

圖5. 與單抗組合相比，MEDI5752優(yōu)先靶向雙陽性細(xì)胞上的CTLA-4[1]

 

MEDI5752在體內(nèi)能優(yōu)先定位于腫瘤部位并抑制腫瘤生長

由于MEDI5752與小鼠PD-1和CTLA-4缺乏交叉反應(yīng)，研究人員使用了一款表達(dá)人PD-1和CTLA-4蛋白（C57BL/6N-Pdcd1tm1(huPDCD1-ICP11)GenoCtla4tm1(huCTLA4-ICP13)Geno）的轉(zhuǎn)基因小鼠來進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。賽業(yè)已引進(jìn)該P(yáng)D-1/CTLA-4雙免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在攜帶小鼠纖維肉瘤MCA205的hPD-1/hCTLA-4小鼠中，與傳統(tǒng)的anti-CTLA4和isotype mAb相比，MEDI5752顯著聚積在腫瘤部位；MEDI5752與傳統(tǒng)的anti-PD-1 mAb在腫瘤部位的聚積程度相似（圖6A-D）。這些結(jié)果說明MEDI5752在腫瘤部位的聚積依賴于與腫瘤表面PD-1的結(jié)合。同時(shí)，這也說明對(duì)比anti-CTLA4 mAb，MEDI5752能更有效地阻斷腫瘤微環(huán)境中的CTLA-4。

 

在MCA205荷瘤模型中，MEDI5752也顯示出了強(qiáng)烈的，劑量依賴性的抗腫瘤活性：當(dāng)注射劑量為10 mg/kg時(shí)，MCA205在超過60%的小鼠中完全清除了腫瘤（圖6E）。此外，與anti-PD-1和anti-CTLA4 mAb對(duì)比，單抗組合并沒有顯著提高荷瘤小鼠生存率，而MEDI5752功效顯著（圖6F）。而且，將人類病毒特異性T細(xì)胞注射到攜帶人病毒肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的OE21腫瘤的NSG小鼠中后，MEDI5752顯著抑制了腫瘤生長（圖6G）。這些結(jié)果說明與anti-CTLA4 mAb相比，MEDI5752在體內(nèi)能優(yōu)先定位于腫瘤部位;而與單抗組合相比，MEDI5752有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

圖6. MEDI5752在體內(nèi)能優(yōu)先定位于腫瘤部位并抑制腫瘤生長[1]

 

MEDI5752在晚期實(shí)體瘤中被證明有抗腫瘤活性

目前，MEDI5752正在進(jìn)行一項(xiàng)針對(duì)晚期實(shí)體瘤的評(píng)估(NCT03530397)，這也是MEDI5752在人體內(nèi)的首次試驗(yàn)。MEDI5752在兩名患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了部分緩解。其中，一名已經(jīng)歷五次化療失敗的61歲胃腺癌患者的腫瘤縮小了60％（圖7A）；另一名從未經(jīng)過治療的51歲腎透明細(xì)胞癌患者的腫瘤縮小了68％（圖7B）。目前，兩名患者的無進(jìn)展（progression-free）生存期已分別有80周和24周，且毒性可控。

圖7. MEDI5752在晚期實(shí)體瘤中有抗腫瘤活性[1]

 

總結(jié)

AstraZeneca這款同時(shí)靶向PD-1和CTLA-4的單價(jià)雙抗MEDI5752在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均顯示出了顯著的抗腫瘤活性。MEDI5752利用“cooperative binding”，在靶向PD-1+ T細(xì)胞的同時(shí)，提高了anti-CTLA-4單臂對(duì)CTLA-4的結(jié)合力，且能優(yōu)先抑制PD-1+細(xì)胞上的CTLA-4。此外，MEDI5752融合了anti-CTLA-4和anti-PD-1的優(yōu)勢(shì)，能引發(fā)對(duì)PD-1的快速內(nèi)化，并能優(yōu)先定位在腫瘤部位。這些都顯示出了PD-1/CTLA-4雙抗的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

 

目前，多家公司在PD-1/CTLA-4雙抗上也均有布局，產(chǎn)品包括中山康方（ Akesobio ）已進(jìn)入phase Ib/II 的AK104、康寧杰瑞（Alphamab）已進(jìn)入phase II的KN046、齊魯制藥（Qilu Pharmaceutical）已進(jìn)入phase I的QL1706等。

 

賽業(yè)生物模式動(dòng)物創(chuàng)新藥物研發(fā)平臺(tái)還可以根據(jù)您的需求提供各種有效的腫瘤研究模型，如傳統(tǒng)免疫缺陷鼠裸鼠、NOD scid、重度免疫缺陷鼠C-NKG和BRGSF、免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠、腫瘤細(xì)胞系移植模型、人源腫瘤組織異種移植模型（CDX）、基因修飾模型及表型分析服務(wù)等。我們可以構(gòu)建各類皮下、原位或者轉(zhuǎn)移瘤模型，并針對(duì)相應(yīng)的模型提供高度定制化的體內(nèi)藥效學(xué)服務(wù)，以滿足您的需求。如有需要，歡迎聯(lián)系我們~

 

PD-1/CTLA-4雙人源化小鼠助力腫瘤研究

品系背景： C57BL/6N

品系構(gòu)建策略：

PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠模型（hPD-1/hCTLA-4）由hPD-1小鼠和hCTLA-4小鼠雜交得到。

 

品系說明：

■ hPD-1和hCTLA-4在小鼠體內(nèi)具有正常的生理表達(dá)和調(diào)節(jié)模式。

■ PD1和CTLA-4胞外域人源化，利于hPD-1和hCTLA-4靶向藥物的識(shí)別。

■ 保留小鼠PD-1和CTLA-4胞內(nèi)域，保證正常的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

■ 小鼠靶基因不表達(dá)，避免交叉反應(yīng)。

小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。

 

研究應(yīng)用：

本模型可用于評(píng)估hPD-1和/或hCTLA-4靶向藥物在免疫健全小鼠體內(nèi)的藥效及安全性：

可以與人源腫瘤細(xì)胞系 MC38-hPD-L1聯(lián)用，構(gòu)建同源腫瘤模型，以測(cè)試靶向人PD-1和人PD-L1的聯(lián)合療法的療效。

 

模型驗(yàn)證：

PD-1和CTLA-4表達(dá)檢測(cè)

圖1. hPD-1和hCTLA-4在hPD-1/hCTLA-4小鼠中的表達(dá)模式與mPD-1和mCTLA-4在野生型小鼠中的表達(dá)模式一致。

用αCD3/αCD29抗體激活從野生型小鼠和hPD-1/hCTLA-4小鼠中分離的脾細(xì)胞。在hPD-1/hCTLA-4小鼠中，傳統(tǒng)CD4+ T細(xì)胞表達(dá)hPD-1和hCTLA-4；在野生型小鼠中，傳統(tǒng)CD4+ T細(xì)胞表達(dá)mPD-1和mCTLA-4。

 

圖2. hPD-1和hCTLA-4在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）中的表達(dá)情況。

在hPD-1/hCTLA-4小鼠和野生型小鼠體內(nèi)接種MCA205小鼠纖維肉瘤細(xì)胞，并分析TILs上鼠源和人源PD-1以及CTLA-4在的表達(dá)情況。