強化病毒生產(chǎn)兩用平臺的應用
1. 摘要
多種基因治療(GT)產(chǎn)品正在開發(fā)當中，以治療此前無法治療的遺傳性疾病。這些高價值產(chǎn)品的年需求量根據(jù)適應癥和發(fā)病率的不同，差異可能高達7 logs。這種廣泛的生產(chǎn)規(guī)模范圍使GT生產(chǎn)平臺化極具挑戰(zhàn)性。此外，對于具有非常高年需求量的適應癥，傳統(tǒng)的貼壁技術，如填充床生物反應器和細胞工廠，不能滿足所需的生產(chǎn)能力。這一趨勢導致GT制造商轉向在攪拌罐生物反應器中使用懸浮細胞進行生產(chǎn)。
盡管攪拌罐生物反應器在抗體和重組蛋白生產(chǎn)方面有良好的過往記錄，并且有多種尺寸可供使用，但這些系統(tǒng)的使用也有諸多限制，包括比蛋白質(zhì)工藝更低的細胞密度，比貼壁細胞培養(yǎng)更低的特異性產(chǎn)率，以及細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的大體積料液帶來的中游和下游瓶頸。
針對工藝強化和鏈接 (整合式連續(xù)工藝) 而設計的新技術可使產(chǎn)量比基于傳統(tǒng)可放大的貼壁技術提高4倍。最近，這些技術已經(jīng)被應用于懸浮細胞培養(yǎng)，達到了與懸浮對照工藝相同的產(chǎn)量。這也意味著，強化和鏈接性的生物反應器可相當于2,000L或以上的攪拌罐反應器體系（STR）。本文將討論這些技術如何彌合產(chǎn)能差距、基因治療平臺化生產(chǎn)、以及減少操作占地。
2. 簡介
2.1 當前的市場考量
在未來的2025年，GT市場預計價值將達到120億美元。這些產(chǎn)品主要針對一些目前沒有治療方法的適應癥，以顯著提高患者的生活質(zhì)量，甚至于可提高患者的生存機會。相較而言，單抗的年需求量(在美國)估計在數(shù)百克(如Remicade®)到數(shù)百公斤(如Rituxan®)之間，基因治療產(chǎn)品的需求量差異可能>7 logs。
圖1. 假設一個患者的體重為75 kg，基于AAV的不同基因治療產(chǎn)品的年需求量vs劑量大小。
例如，用于利伯氏先天性黑蒙的基于AAV的治療劑量可能為1 x 1011病毒基因組(vgs)，而治療脊肌萎縮癥 (SMA) 的劑量可能為1x1014 vgs。
此外，杜氏肌萎縮癥(DMD)的治療預計將導致1 × 1020 vgs的年需求量，這是由每個患者的高劑量和年需求量結合得出的。
由于GT開發(fā)商通常會試圖以不同的適應癥為目標，年度需求的顯著差異會導致GT制造商針對不同類型的應用采取不同的技術，而不是采用單一的技術，并像單抗行業(yè)那樣，根據(jù)適應癥的需求而調(diào)整規(guī)模。技術創(chuàng)新是否能夠在不進行重大平臺調(diào)整的情況下實現(xiàn)顯著的靈活性，以適應不同的目標適應癥?
2.2 GT制造的技術藍圖，離我們還有多遠？
傳統(tǒng)的病毒載體生產(chǎn)依賴于規(guī)模擴展的方法，以達到目標規(guī)模。這種方法使用的技術包括細胞工廠和培養(yǎng)瓶。與其它類型的生物制品一樣，規(guī)模擴展以獲得大量的病毒載體的方法也存在一些缺點，如產(chǎn)量限制、占地、人工操作數(shù)量等，導致出現(xiàn)占地面積、資本支出、運營成本和再現(xiàn)性方面的問題。
固定床生物反應器，歷史上曾被用于疫苗應用，已經(jīng)調(diào)整用于基因治療領域，其提供了一個可規(guī)模放大的解決方案，以使用貼壁細胞生產(chǎn)病毒載體。然而，這種生物反應器不能提供足夠的產(chǎn)能。這種產(chǎn)能的限制促使基因治療的開發(fā)商將注意力轉向在攪拌罐生物反應器(STR)中進行的懸浮細胞培養(yǎng)。
圖2. 目標年產(chǎn)量和收獲體積與用于病毒載體生產(chǎn)的傳統(tǒng)技術的產(chǎn)能的比較，其中BioR =生物反應器。用于得出這些結果的假設為：產(chǎn)率= 2 x104 vg/cell, CDAT：200,000cells/cm2(細胞工廠 & 固定床) 1x106 cells/ml (STR)。收獲體積=0.5L/CF 10 (高達50單位/批)，0.1ml/cm2固定床 (假設與STR相同的ml/cell，且總體積50%收獲)，STR：標準體積。
STR似乎是GT制造中最靈活且可放大的傳統(tǒng)技術。然而，對于年需求量較高的適應癥，例如A型血友病或杜氏肌萎縮癥，即使是2,000L的STR也不夠。對于這樣的情況，產(chǎn)能差距只能通過使用多個系統(tǒng)并行地規(guī)模擴展生產(chǎn)來解決。Camau等人(n.d.)通過計算不同技術中劑量為1x1014vgs的產(chǎn)品每劑的產(chǎn)品成本(CoG)，說明了可放大性的好處。結果表明，多層培養(yǎng)瓶的每劑產(chǎn)品成本為~15,000USD，1,000L STR和333m2填料床生物反應器的每劑產(chǎn)品成本分別為~12,000 USD和~8,000USD。本研究表明，為了達到同樣的產(chǎn)量，STR需要更高的DNA/細胞比例 (1.5 ug/M細胞 vs 1ug/M細胞)，從而相對于填充床反應器，導致更高的CoG/劑。本文中顯示的CoG/劑比高劑量單抗產(chǎn)品的每劑產(chǎn)品成本高10至500倍。技術創(chuàng)新能否在縮小規(guī)模差距的同時降低病毒載體制造的制造成本?
3. 攪拌罐生物反應器在基因治療制造中的前景
STR有多個優(yōu)點，首先這些系統(tǒng)的采購來源較多，并且已被很好地理解，因為它們已經(jīng)被成功地應用于蛋白質(zhì)和疫苗生產(chǎn)。此外，許多進入基因治療領域的工藝開發(fā)專業(yè)人員都有已建立的、基于懸液培養(yǎng)的抗體和蛋白質(zhì)生產(chǎn)背景。懸浮培養(yǎng)中病毒載體生產(chǎn)始于細胞的擴增，以創(chuàng)造足夠的生物量，用于接種最終的生物反應器規(guī)模。一旦細胞在最終的生物反應器中生長至~1 × 106 cells/ml (這與典型的抗體工藝相比，是相當?shù)偷臄?shù)值)，進行細胞轉染步驟。細胞培養(yǎng)、轉染和病毒生產(chǎn)階段通常以批次和補料分批模式進行，也無法除培養(yǎng)基或進行洗脫步驟。當使用灌流時，需要細胞截留裝置，其可能對細胞健康有些害。對于細胞內(nèi)產(chǎn)物，在工藝結束時，得在生物反應器中進行直接裂解步驟。之后，在生物反應器中進行Benzonase處理，以消解DNA。經(jīng)Benzonase處理的原液隨后被澄清，以進行下游工藝(DSP)的后續(xù)階段。
圖3 使用攪拌罐生物反應器生產(chǎn)1,000L收獲體積的GT制造中隨工藝步驟的體積變化示意圖。紅色點表示需處理的最大體積。
當使用1,000L 收獲體積的STR時，必須在上游和中游工藝之間的連接點處理大量含有培養(yǎng)基的產(chǎn)物，這將影響工廠設計、占地面積以及操作的方便性。對于需要多個STR并行操作的適應癥，如杜氏肌萎縮癥，這種影響將被進一步放大。
單抗開發(fā)商已經(jīng)采用了整合式連續(xù)工藝技術，將灌流操作鏈接至多柱層析系統(tǒng)，以提高產(chǎn)量，同時降低占地面積。考慮到HEK293細胞的剪切敏感性，使其難以接入ATF和TFF等細胞截留系統(tǒng)，所以，將前述工藝設計直接轉移到使用STR的GT制造中會帶來一些挑戰(zhàn)。這也意味著在使用STR的整個制造過程中，進行培養(yǎng)基置換是非常有挑戰(zhàn)性的步驟。
STR的高占地面積，加上對中間儲罐的需求以及獨立單元操作的使用，導致了非常高的操作占地面積。圖4所示為容納1,000LSTR工藝所需的占地面積。支持這一工藝所需的總占地面積是97m2。對于需要多個生產(chǎn)鏈并行運行的高年度需求生產(chǎn)，中游工藝設備可能可以跨批共享，然而，這不會顯著減少占地。技術創(chuàng)新能否消除GT制造中游和下游工藝操作的瓶頸?
圖4操作1,000L工藝的潔凈室示意圖，包括種子擴增、細胞培養(yǎng)和病毒生產(chǎn)以及澄清序列，總占地97m2。
4. 工藝強化和鏈接：GT制造的模式轉變
Univercells Technologies開發(fā)了一系列下一代技術，旨在解決基因治療和疫苗生產(chǎn)商在需求、產(chǎn)品成本和工廠占地方面面臨的挑戰(zhàn)。這些技術應用了工藝強化和鏈接的原理，以重新定義GT制造中的可放大性。強化指的是在更小的操作占地中實現(xiàn)高產(chǎn)量，而鏈接指的是將不同的單元操作連接在一起，以實現(xiàn)整合的連續(xù)生物工藝。
工藝強化主要是通過在結構化卷式生物反應器 scale-X™中的生物質(zhì)濃縮和固定來實現(xiàn)。通過將中游單元操作連接到NevoLine™平臺的scale-X生物反應器，強化得到了進一步的提升。NevoLine平臺能夠在最重要的步驟中降低體積 (圖3)。
4.1 scale-X生物反應器 – 基于懸浮和貼壁GT制造的兩用平臺
scale- x™生物反應器組合包括使用卷式固定床的自動化、強化生物反應器 (圖5)，其提供不同規(guī)模的配置，以促進工藝從研發(fā)到商業(yè)規(guī)模GMP生產(chǎn)的過渡。scale-X生物反應器由獨特的雙層結構組成，其中，親水性PET層用于細胞生長，疏水性聚丙烯網(wǎng)層用于培養(yǎng)基流動。
圖5. scale-X生物反應器中，獨特的結構化雙層設計示意圖
上述特點與結構化設計相結合，可實現(xiàn)細胞均勻分布以及營養(yǎng)物的高度利用，同時限制對細胞的剪切。這種設計還提高了可放大性，并增強了工藝的穩(wěn)健性，因為在不同規(guī)模和生產(chǎn)批次之間可維持固定床壓實性。
Scale-X生物反應器產(chǎn)品系列可分為三組：hydro (研發(fā)規(guī)模)，carbo (中等規(guī)模、規(guī)模放大研究、小批量臨床和商業(yè)化生產(chǎn))以及nitro (大規(guī)模臨床和商業(yè)規(guī)模生產(chǎn))。在scale-X生物反應器中，細胞貼附或捕獲在纖維內(nèi)，而培養(yǎng)基流動進、出生物反應器。
圖6. Univercells Technologies按規(guī)模和應用劃分的scale-X生物反應器產(chǎn)品組合以及NevoLine上游平臺
Scale-X生物反應器的設計已被證實可獲得相比其它基于貼壁細胞病毒生產(chǎn)的替代性系統(tǒng)顯著更高的產(chǎn)量，使其成為最先進的、基于貼壁細胞的病毒載體和病毒疫苗生產(chǎn)技術。
4.1.1. Scale-X生物反應器中的貼壁細胞培養(yǎng)
Duyck 等 (2019)在一個簡單的概念驗證（PoC）研究中，描述了結構化固定床設計的使用，其在有限優(yōu)化的前提下，使用貼壁HEK293細胞，生產(chǎn)基于AAV的產(chǎn)品，相比在細胞工廠中進行的標準工藝，接種和轉染密度降低了3倍。在此研究中，細胞生長培養(yǎng)基用量降低了~90%，并對洗脫步驟數(shù)進行了優(yōu)化。
圖7. 相對于在細胞工廠中進行的參考工藝，貼壁HEK293 AAV產(chǎn)品的病毒載體產(chǎn)量（以vg/cm2為單位）的百分比。紅條柱代表scale-X hydro生物反應器的產(chǎn)量，而灰色柱代表傳統(tǒng)固定床生物反應器(PB)的產(chǎn)量。
此案例研究的結果表明，在基于貼壁的GT生產(chǎn)中，scale-X技術有多個關鍵優(yōu)勢：
4.1.2 Scale-X生物反應器中的懸浮細胞培養(yǎng)
最近的一項PoC研究探索了scale-X生物反應器在懸浮細胞培養(yǎng)中的優(yōu)勢，其使用HEK293細胞，在無血清培養(yǎng)基中，生產(chǎn)基于腺病毒的疫苗。實驗進行了3次生物反應器運行，以評估（1）固定床的細胞截留效率，（2）固定床與懸浮培養(yǎng)對照組中的細胞生長趨勢，以及(3)達到參考工藝70,000 vp/cell產(chǎn)率的能力。比較使用接種密度為5x105 cells/mL的250 mL搖瓶。
在生物反應器運行#1的實驗中，進行了簡單的工藝轉移。在生物反應器運行#2的實驗中，生產(chǎn)階段的持續(xù)時間在3天后增加，以便觀察在3天的病毒生產(chǎn)后產(chǎn)量是否達到穩(wěn)定狀態(tài)，就像參考工藝中的情況那樣。在生物反應器運行#3的實驗中，提高了感染時的細胞密度，以評估生物量對產(chǎn)量的影響。
圖8. 相對于在搖瓶中進行的對照工藝，懸浮HEK293 腺病毒產(chǎn)品的特異性細胞產(chǎn)率（vp/cell）。紅色柱代表scale-X hydro生物反應器的產(chǎn)率，而灰色柱代表搖瓶的產(chǎn)率。
本案例研究的結果證實了對于基于懸浮的GT生產(chǎn)，scale-X技術的多個關鍵好處：
4.2 NevoLine平臺 – 優(yōu)化上游到下游的生產(chǎn)線
在scale-X生物反應器中，由于細胞濃縮在固定床中，當培養(yǎng)基進出生物反應器時，它們?nèi)酝Ａ粼谏锓磻髦校苊饬耸褂脗鹘y(tǒng)細胞截留系統(tǒng)時，與剪切敏感性相關的挑戰(zhàn)。NevoLine系統(tǒng)可以實現(xiàn)灌流液澄清和濃縮(在連續(xù)或批次模式下)，從而將濃縮且澄清的原液轉移至DSP車間。
圖9 NevoLine上游平臺中包含的單元操作示意圖，其主要包括在scale-X生物反應器中進行細胞培養(yǎng)和病毒生產(chǎn)，以及之后進行的單步或多步澄清、濃縮以及洗濾。
在NevoLine中，生產(chǎn)過程從在平面器皿或搖瓶中的n-2種子階段開始，然后是在平面器皿或波浪型生物反應器中進行的n-1階段。scale-X nitro生物反應器可以在低細胞密度下接種，然后在固定床中進行生物量倍增。scale-X生物反應器的最大罐體積為60L，可用于600m2的nitro。培養(yǎng)基循環(huán)或灌流通過固定床。在灌流模式中，在線收集并濃縮灌流液。對于裂解工藝，細胞裂解通過在生物反應器或收獲罐中使用Benzonase處理，以裂解截留在固定床中的細胞。
NevoLine獲得的最終產(chǎn)物是澄清且濃縮的物料，可直接進入DSP。工藝序列和部件可以根據(jù)客戶的特定工藝而調(diào)整。圖10所示為NevoLine中的整合式連續(xù)工藝，可以將進入DSP的體積降低到100L以下。
圖10. 在NevoLine平臺上使用scale-X生物反應器進行的GT制造工藝步驟的體積變化示意圖。紅色的點表示在基于STR的工藝中，待處理體積最大的工藝步驟，在NevoLine中被降低至<100L。
5. GT制造技術創(chuàng)新的有形和無形效益
本文介紹了技術創(chuàng)新投資的有形和無形效益。新技術對GT制造現(xiàn)狀的積極影響總結如下：
6. 技術創(chuàng)新賦能生物制造的下一個變革
本文強調(diào)了GT制造面臨的一些挑戰(zhàn)，包括產(chǎn)能限制、靈活性、工藝平臺化以及產(chǎn)品成本。本文還顯示，使用目前市面上的技術，工藝由技術定義，例如，填充床生物反應器和細胞工廠用于貼壁細胞培養(yǎng)，而STR用于懸浮細胞培養(yǎng)。此外，跨技術的工藝轉移會導致產(chǎn)量的顯著下降。
本文的其它見解包括規(guī)模和處理體積之間的權衡，因為填充床生物反應器的處理體積和生產(chǎn)能力較低。而另一方面，STR可提供高達2000L的產(chǎn)能，但產(chǎn)生的大體積可能會導致中游工藝的瓶頸。此外，對于年需求量非常大的產(chǎn)品，即使是2000 L的STR也不能滿足產(chǎn)能需求。
圖11操作基于Nevoline工藝的潔凈室示意圖，包括種子擴增、細胞培養(yǎng)、病毒生產(chǎn)和澄清序列，總占地面積為30m2。
技術創(chuàng)新為上述挑戰(zhàn)提供了解決方案。本文證明了新型結構化固定床生物反應器可以使工藝與技術脫鉤，即其可用于懸浮和貼壁細胞工藝。對于GT開發(fā)商來說，這提供了一個獨特的機會，可以將工藝平臺化，輕松地使其適應可放大的技術，從而加快開發(fā)進度，并降低成本。對于CDMO來說，這也提供了一個獨特的機會，可通過采用兩用技術，提高潔凈室的利用率。此外，與其它可放大技術相比，結構化固定床設計可以提高懸浮工藝和貼壁工藝的特異性細胞產(chǎn)率。
當這些結構化固定床生物反應器與整合式連續(xù)生產(chǎn)的自動化技術相結合時，處理體積可從1000L降低到<100 L，消除了中游工藝的瓶頸。
多種基因治療(GT)產(chǎn)品正在開發(fā)當中，以治療此前無法治療的遺傳性疾病。這些高價值產(chǎn)品的年需求量根據(jù)適應癥和發(fā)病率的不同，差異可能高達7 logs。這種廣泛的生產(chǎn)規(guī)模范圍使GT生產(chǎn)平臺化極具挑戰(zhàn)性。此外，對于具有非常高年需求量的適應癥，傳統(tǒng)的貼壁技術，如填充床生物反應器和細胞工廠，不能滿足所需的生產(chǎn)能力。這一趨勢導致GT制造商轉向在攪拌罐生物反應器中使用懸浮細胞進行生產(chǎn)。
盡管攪拌罐生物反應器在抗體和重組蛋白生產(chǎn)方面有良好的過往記錄，并且有多種尺寸可供使用，但這些系統(tǒng)的使用也有諸多限制，包括比蛋白質(zhì)工藝更低的細胞密度，比貼壁細胞培養(yǎng)更低的特異性產(chǎn)率，以及細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的大體積料液帶來的中游和下游瓶頸。
針對工藝強化和鏈接 (整合式連續(xù)工藝) 而設計的新技術可使產(chǎn)量比基于傳統(tǒng)可放大的貼壁技術提高4倍。最近，這些技術已經(jīng)被應用于懸浮細胞培養(yǎng)，達到了與懸浮對照工藝相同的產(chǎn)量。這也意味著，強化和鏈接性的生物反應器可相當于2,000L或以上的攪拌罐反應器體系（STR）。本文將討論這些技術如何彌合產(chǎn)能差距、基因治療平臺化生產(chǎn)、以及減少操作占地。
2. 簡介
2.1 當前的市場考量
在未來的2025年，GT市場預計價值將達到120億美元。這些產(chǎn)品主要針對一些目前沒有治療方法的適應癥，以顯著提高患者的生活質(zhì)量，甚至于可提高患者的生存機會。相較而言，單抗的年需求量(在美國)估計在數(shù)百克(如Remicade®)到數(shù)百公斤(如Rituxan®)之間，基因治療產(chǎn)品的需求量差異可能>7 logs。
圖1. 假設一個患者的體重為75 kg，基于AAV的不同基因治療產(chǎn)品的年需求量vs劑量大小。
例如，用于利伯氏先天性黑蒙的基于AAV的治療劑量可能為1 x 1011病毒基因組(vgs)，而治療脊肌萎縮癥 (SMA) 的劑量可能為1x1014 vgs。
此外，杜氏肌萎縮癥(DMD)的治療預計將導致1 × 1020 vgs的年需求量，這是由每個患者的高劑量和年需求量結合得出的。
由于GT開發(fā)商通常會試圖以不同的適應癥為目標，年度需求的顯著差異會導致GT制造商針對不同類型的應用采取不同的技術，而不是采用單一的技術，并像單抗行業(yè)那樣，根據(jù)適應癥的需求而調(diào)整規(guī)模。技術創(chuàng)新是否能夠在不進行重大平臺調(diào)整的情況下實現(xiàn)顯著的靈活性，以適應不同的目標適應癥?
2.2 GT制造的技術藍圖，離我們還有多遠？
傳統(tǒng)的病毒載體生產(chǎn)依賴于規(guī)模擴展的方法，以達到目標規(guī)模。這種方法使用的技術包括細胞工廠和培養(yǎng)瓶。與其它類型的生物制品一樣，規(guī)模擴展以獲得大量的病毒載體的方法也存在一些缺點，如產(chǎn)量限制、占地、人工操作數(shù)量等，導致出現(xiàn)占地面積、資本支出、運營成本和再現(xiàn)性方面的問題。
固定床生物反應器，歷史上曾被用于疫苗應用，已經(jīng)調(diào)整用于基因治療領域，其提供了一個可規(guī)模放大的解決方案，以使用貼壁細胞生產(chǎn)病毒載體。然而，這種生物反應器不能提供足夠的產(chǎn)能。這種產(chǎn)能的限制促使基因治療的開發(fā)商將注意力轉向在攪拌罐生物反應器(STR)中進行的懸浮細胞培養(yǎng)。
圖2. 目標年產(chǎn)量和收獲體積與用于病毒載體生產(chǎn)的傳統(tǒng)技術的產(chǎn)能的比較，其中BioR =生物反應器。用于得出這些結果的假設為：產(chǎn)率= 2 x104 vg/cell, CDAT：200,000cells/cm2(細胞工廠 & 固定床) 1x106 cells/ml (STR)。收獲體積=0.5L/CF 10 (高達50單位/批)，0.1ml/cm2固定床 (假設與STR相同的ml/cell，且總體積50%收獲)，STR：標準體積。
STR似乎是GT制造中最靈活且可放大的傳統(tǒng)技術。然而，對于年需求量較高的適應癥，例如A型血友病或杜氏肌萎縮癥，即使是2,000L的STR也不夠。對于這樣的情況，產(chǎn)能差距只能通過使用多個系統(tǒng)并行地規(guī)模擴展生產(chǎn)來解決。Camau等人(n.d.)通過計算不同技術中劑量為1x1014vgs的產(chǎn)品每劑的產(chǎn)品成本(CoG)，說明了可放大性的好處。結果表明，多層培養(yǎng)瓶的每劑產(chǎn)品成本為~15,000USD，1,000L STR和333m2填料床生物反應器的每劑產(chǎn)品成本分別為~12,000 USD和~8,000USD。本研究表明，為了達到同樣的產(chǎn)量，STR需要更高的DNA/細胞比例 (1.5 ug/M細胞 vs 1ug/M細胞)，從而相對于填充床反應器，導致更高的CoG/劑。本文中顯示的CoG/劑比高劑量單抗產(chǎn)品的每劑產(chǎn)品成本高10至500倍。技術創(chuàng)新能否在縮小規(guī)模差距的同時降低病毒載體制造的制造成本?
3. 攪拌罐生物反應器在基因治療制造中的前景
STR有多個優(yōu)點，首先這些系統(tǒng)的采購來源較多，并且已被很好地理解，因為它們已經(jīng)被成功地應用于蛋白質(zhì)和疫苗生產(chǎn)。此外，許多進入基因治療領域的工藝開發(fā)專業(yè)人員都有已建立的、基于懸液培養(yǎng)的抗體和蛋白質(zhì)生產(chǎn)背景。懸浮培養(yǎng)中病毒載體生產(chǎn)始于細胞的擴增，以創(chuàng)造足夠的生物量，用于接種最終的生物反應器規(guī)模。一旦細胞在最終的生物反應器中生長至~1 × 106 cells/ml (這與典型的抗體工藝相比，是相當?shù)偷臄?shù)值)，進行細胞轉染步驟。細胞培養(yǎng)、轉染和病毒生產(chǎn)階段通常以批次和補料分批模式進行，也無法除培養(yǎng)基或進行洗脫步驟。當使用灌流時，需要細胞截留裝置，其可能對細胞健康有些害。對于細胞內(nèi)產(chǎn)物，在工藝結束時，得在生物反應器中進行直接裂解步驟。之后，在生物反應器中進行Benzonase處理，以消解DNA。經(jīng)Benzonase處理的原液隨后被澄清，以進行下游工藝(DSP)的后續(xù)階段。
圖3 使用攪拌罐生物反應器生產(chǎn)1,000L收獲體積的GT制造中隨工藝步驟的體積變化示意圖。紅色點表示需處理的最大體積。
單抗開發(fā)商已經(jīng)采用了整合式連續(xù)工藝技術，將灌流操作鏈接至多柱層析系統(tǒng)，以提高產(chǎn)量，同時降低占地面積。考慮到HEK293細胞的剪切敏感性，使其難以接入ATF和TFF等細胞截留系統(tǒng)，所以，將前述工藝設計直接轉移到使用STR的GT制造中會帶來一些挑戰(zhàn)。這也意味著在使用STR的整個制造過程中，進行培養(yǎng)基置換是非常有挑戰(zhàn)性的步驟。
STR的高占地面積，加上對中間儲罐的需求以及獨立單元操作的使用，導致了非常高的操作占地面積。圖4所示為容納1,000LSTR工藝所需的占地面積。支持這一工藝所需的總占地面積是97m2。對于需要多個生產(chǎn)鏈并行運行的高年度需求生產(chǎn)，中游工藝設備可能可以跨批共享，然而，這不會顯著減少占地。技術創(chuàng)新能否消除GT制造中游和下游工藝操作的瓶頸?
圖4操作1,000L工藝的潔凈室示意圖，包括種子擴增、細胞培養(yǎng)和病毒生產(chǎn)以及澄清序列，總占地97m2。
4. 工藝強化和鏈接：GT制造的模式轉變
Univercells Technologies開發(fā)了一系列下一代技術，旨在解決基因治療和疫苗生產(chǎn)商在需求、產(chǎn)品成本和工廠占地方面面臨的挑戰(zhàn)。這些技術應用了工藝強化和鏈接的原理，以重新定義GT制造中的可放大性。強化指的是在更小的操作占地中實現(xiàn)高產(chǎn)量，而鏈接指的是將不同的單元操作連接在一起，以實現(xiàn)整合的連續(xù)生物工藝。
工藝強化主要是通過在結構化卷式生物反應器 scale-X™中的生物質(zhì)濃縮和固定來實現(xiàn)。通過將中游單元操作連接到NevoLine™平臺的scale-X生物反應器，強化得到了進一步的提升。NevoLine平臺能夠在最重要的步驟中降低體積 (圖3)。
4.1 scale-X生物反應器 – 基于懸浮和貼壁GT制造的兩用平臺
scale- x™生物反應器組合包括使用卷式固定床的自動化、強化生物反應器 (圖5)，其提供不同規(guī)模的配置，以促進工藝從研發(fā)到商業(yè)規(guī)模GMP生產(chǎn)的過渡。scale-X生物反應器由獨特的雙層結構組成，其中，親水性PET層用于細胞生長，疏水性聚丙烯網(wǎng)層用于培養(yǎng)基流動。
圖5. scale-X生物反應器中，獨特的結構化雙層設計示意圖
上述特點與結構化設計相結合，可實現(xiàn)細胞均勻分布以及營養(yǎng)物的高度利用，同時限制對細胞的剪切。這種設計還提高了可放大性，并增強了工藝的穩(wěn)健性，因為在不同規(guī)模和生產(chǎn)批次之間可維持固定床壓實性。
Scale-X生物反應器產(chǎn)品系列可分為三組：hydro (研發(fā)規(guī)模)，carbo (中等規(guī)模、規(guī)模放大研究、小批量臨床和商業(yè)化生產(chǎn))以及nitro (大規(guī)模臨床和商業(yè)規(guī)模生產(chǎn))。在scale-X生物反應器中，細胞貼附或捕獲在纖維內(nèi)，而培養(yǎng)基流動進、出生物反應器。
圖6. Univercells Technologies按規(guī)模和應用劃分的scale-X生物反應器產(chǎn)品組合以及NevoLine上游平臺
Scale-X生物反應器的設計已被證實可獲得相比其它基于貼壁細胞病毒生產(chǎn)的替代性系統(tǒng)顯著更高的產(chǎn)量，使其成為最先進的、基于貼壁細胞的病毒載體和病毒疫苗生產(chǎn)技術。
4.1.1. Scale-X生物反應器中的貼壁細胞培養(yǎng)
Duyck 等 (2019)在一個簡單的概念驗證（PoC）研究中，描述了結構化固定床設計的使用，其在有限優(yōu)化的前提下，使用貼壁HEK293細胞，生產(chǎn)基于AAV的產(chǎn)品，相比在細胞工廠中進行的標準工藝，接種和轉染密度降低了3倍。在此研究中，細胞生長培養(yǎng)基用量降低了~90%，并對洗脫步驟數(shù)進行了優(yōu)化。
圖7. 相對于在細胞工廠中進行的參考工藝，貼壁HEK293 AAV產(chǎn)品的病毒載體產(chǎn)量（以vg/cm2為單位）的百分比。紅條柱代表scale-X hydro生物反應器的產(chǎn)量，而灰色柱代表傳統(tǒng)固定床生物反應器(PB)的產(chǎn)量。
此案例研究的結果表明，在基于貼壁的GT生產(chǎn)中，scale-X技術有多個關鍵優(yōu)勢：
- 使用最小的優(yōu)化，即可將工藝從平面器皿轉移到可放大技術，并獲得相同的性能：這可以顯著降低工藝開發(fā)和規(guī)模放大時間線和成本。這也意味著GT開發(fā)商現(xiàn)在可以使用平面器皿來滿足極低年需求量的產(chǎn)品，如利伯氏先天性黑蒙，并很容易將這些平臺工藝轉移到可規(guī)模放大的技術，如scale-X生物反應器。
- 可以降低接種密度：降低接種密度可以減小到達最終生物反應器的種子擴增鏈的規(guī)模，減少占地、人員需求和產(chǎn)品的總成本。
- 可以降低CDAT：DNA和PEI是病毒載體制造中的一些關鍵成本驅(qū)動因素。由于這些試劑的添加與轉染時的細胞密度有關，降低轉染時的細胞密度將對產(chǎn)品成本產(chǎn)生重大影響。
- 與傳統(tǒng)用于基于貼壁細胞的病毒載體生產(chǎn)的可放大技術相比，可以達到顯著更高的產(chǎn)量。與傳統(tǒng)填充床生物反應器相比，scale-X生物反應器的產(chǎn)量提高了4倍�？紤]到GT行業(yè)的產(chǎn)能挑戰(zhàn) (圖2)，這些結果清楚地說明了下一代技術在彌補GT生物工藝產(chǎn)能差距方面的作用。此外，考慮到GT制造中的物料成本，用相同數(shù)量的原材料生產(chǎn)更多產(chǎn)品的能力將在降低產(chǎn)品成本、以克服獲得GT產(chǎn)品的經(jīng)濟阻礙方面發(fā)揮關鍵作用。
4.1.2 Scale-X生物反應器中的懸浮細胞培養(yǎng)
最近的一項PoC研究探索了scale-X生物反應器在懸浮細胞培養(yǎng)中的優(yōu)勢，其使用HEK293細胞，在無血清培養(yǎng)基中，生產(chǎn)基于腺病毒的疫苗。實驗進行了3次生物反應器運行，以評估（1）固定床的細胞截留效率，（2）固定床與懸浮培養(yǎng)對照組中的細胞生長趨勢，以及(3)達到參考工藝70,000 vp/cell產(chǎn)率的能力。比較使用接種密度為5x105 cells/mL的250 mL搖瓶。
在生物反應器運行#1的實驗中，進行了簡單的工藝轉移。在生物反應器運行#2的實驗中，生產(chǎn)階段的持續(xù)時間在3天后增加，以便觀察在3天的病毒生產(chǎn)后產(chǎn)量是否達到穩(wěn)定狀態(tài)，就像參考工藝中的情況那樣。在生物反應器運行#3的實驗中，提高了感染時的細胞密度，以評估生物量對產(chǎn)量的影響。
圖8. 相對于在搖瓶中進行的對照工藝，懸浮HEK293 腺病毒產(chǎn)品的特異性細胞產(chǎn)率（vp/cell）。紅色柱代表scale-X hydro生物反應器的產(chǎn)率，而灰色柱代表搖瓶的產(chǎn)率。
本案例研究的結果證實了對于基于懸浮的GT生產(chǎn)，scale-X技術的多個關鍵好處：
- 可以在結構化固定床生物反應器中截留并生長懸浮細胞。懸浮細胞被成功截留在結構化固定床生物反應器中，細胞生長階段上清液的生物量低于5%，病毒產(chǎn)生階段低于細胞的20%。
- 可以快速將基于懸浮的工藝轉移至結構化固定床生物反應器：結果清楚地顯示，即使沒有對工藝進行更改(運行#1的實驗中)，也超過了70,000 vp/cell的特異性細胞產(chǎn)率。
- 可以提高結構化固定床生物反應器中進行的工藝的穩(wěn)健性。在41至44小時之間，不同運行的PDT相當。
- 對于懸浮系統(tǒng)，結構化固定床生物反應器有可能潛在地提高特異性細胞產(chǎn)率：相比搖瓶對照組，所有scale-X運行都實現(xiàn)了更高的特異性細胞產(chǎn)率。在運行#3實驗的最佳情況下，scale-X中的特異性產(chǎn)率是搖瓶的1.7倍，這個值為結構化固定床生物反應器中基于懸浮培養(yǎng)的工藝優(yōu)化所能實現(xiàn)的目標奠定了基礎。
- 改用scale-X生物反應器可以降低培養(yǎng)基消耗。在實驗中，scale-X生物反應器的單位細胞培養(yǎng)基用量比搖瓶低12.5%。
- Scale-X生物反應器是唯一的雙用途平臺技術，可使用懸浮和貼壁細胞進行病毒生產(chǎn)。目前的GT制造技術分為貼壁技術(平面器皿、固定床生物反應器)和懸浮技術(STR)。本案例研究，結合Duyck等人(2019年)的研究，第一次表明，有可能將技術與工藝脫鉤，而采用能同時實現(xiàn)基于貼壁和懸浮細胞的病毒生產(chǎn)的系統(tǒng)，且其可簡化跨技術的工藝轉移。
4.2 NevoLine平臺 – 優(yōu)化上游到下游的生產(chǎn)線
在scale-X生物反應器中，由于細胞濃縮在固定床中，當培養(yǎng)基進出生物反應器時，它們?nèi)酝Ａ粼谏锓磻髦校苊饬耸褂脗鹘y(tǒng)細胞截留系統(tǒng)時，與剪切敏感性相關的挑戰(zhàn)。NevoLine系統(tǒng)可以實現(xiàn)灌流液澄清和濃縮(在連續(xù)或批次模式下)，從而將濃縮且澄清的原液轉移至DSP車間。
圖9 NevoLine上游平臺中包含的單元操作示意圖，其主要包括在scale-X生物反應器中進行細胞培養(yǎng)和病毒生產(chǎn)，以及之后進行的單步或多步澄清、濃縮以及洗濾。
在NevoLine中，生產(chǎn)過程從在平面器皿或搖瓶中的n-2種子階段開始，然后是在平面器皿或波浪型生物反應器中進行的n-1階段。scale-X nitro生物反應器可以在低細胞密度下接種，然后在固定床中進行生物量倍增。scale-X生物反應器的最大罐體積為60L，可用于600m2的nitro。培養(yǎng)基循環(huán)或灌流通過固定床。在灌流模式中，在線收集并濃縮灌流液。對于裂解工藝，細胞裂解通過在生物反應器或收獲罐中使用Benzonase處理，以裂解截留在固定床中的細胞。
NevoLine獲得的最終產(chǎn)物是澄清且濃縮的物料，可直接進入DSP。工藝序列和部件可以根據(jù)客戶的特定工藝而調(diào)整。圖10所示為NevoLine中的整合式連續(xù)工藝，可以將進入DSP的體積降低到100L以下。
圖10. 在NevoLine平臺上使用scale-X生物反應器進行的GT制造工藝步驟的體積變化示意圖。紅色的點表示在基于STR的工藝中，待處理體積最大的工藝步驟，在NevoLine中被降低至<100L。
5. GT制造技術創(chuàng)新的有形和無形效益
本文介紹了技術創(chuàng)新投資的有形和無形效益。新技術對GT制造現(xiàn)狀的積極影響總結如下：
| 機會 | 描述 | 影響 |
| 工藝強化 | 卷式固定床雙層設計可促進細胞在PET織物微環(huán)境中的截留，同時允許培養(yǎng)基和試劑流過網(wǎng)狀層而不干擾細胞；這是一個非常重要的優(yōu)勢，因為它可實現(xiàn)灌流操作，且降低了處理體積，而不需要ATF/TFF系統(tǒng)，后者是額外的單元操作，是產(chǎn)物和細胞活性損失的潛在原因。此外，將單元操作鏈接在一起，進一步降低了處理體積。 | 低操作占地，降低資本支出 |
| 工藝的靈活性 | 將細胞（貼壁或懸�。┙亓粼诠潭ù仓械哪芰υ试S漂洗生物反應器，例如去除對細胞有毒性的殘余PEI，因此，生物反應器漂洗可以對整體產(chǎn)量產(chǎn)生積極的影響。 此外，NevoLine平臺的設計考慮了靈活性，以便通過鏈接流路配置及配方設置，實現(xiàn)不同的工藝設計。 |
簡化多產(chǎn)品生產(chǎn) |
| 整合的連續(xù)工藝 | NevoLine是一種自動化系統(tǒng)，可實現(xiàn)整合式連續(xù)工藝，無需操作員干預。 | 更高的產(chǎn)量 & 工藝穩(wěn)健性 |
| 精簡的種子擴增 | 對貼壁細胞培養(yǎng)的一種批評是基于平面器皿的種子擴增操作的耗時和繁瑣性。 這可以用波浪生物反應器來克服。懸浮細胞種子擴增更簡單，而可采用固定床生物反應器。在scale-X生物反應器中，可以降低傳代數(shù)，因為生物反應器可以使用較低的細胞密度接種，最終的生物量擴增在生物反應器內(nèi)發(fā)生。 |
占地 & 人工干預減少，降低了資本支出，同時勞動力成本降低，工藝穩(wěn)健性提供 |
| 易于實現(xiàn)工藝平臺化的開發(fā) | 本文證實，scale-X生物反應器可以簡化基于貼壁細胞和懸浮細胞的工藝轉移，以最少的運行次數(shù)，達到目標產(chǎn)量。 | 降低開發(fā)時間成本 |
| 可放大性 | Scale-X生物反應器提供從2.4m2到600 m2的多種配置，以支持客戶開發(fā)旅程的不同階段。這些系統(tǒng)在設計上具有良好的可放大性，因為結構化的固定床確保了不同規(guī)模固定床的均勻壓實。 | 降低開發(fā)時間成本 更高的工藝穩(wěn)健性 |
| 增強工藝性能 | 本文報道的結果表明，在沒有進行大量優(yōu)化工作的情況下，對于貼壁和懸浮細胞培養(yǎng)，scale-X生物反應器的特異性細胞產(chǎn)率始終高于競爭技術。這為通過工藝優(yōu)化，提升系統(tǒng)性能，設定了基礎。 | 更高的產(chǎn)能和更低的產(chǎn)品成本 |
| 工藝效率 | USP：對于某些試劑，添加到工藝中的體積高度取決于需要處理的總體積，如用于細胞裂解的去垢劑(如Triton)以及用于DNA消解的Benzonase。當使用scale-X生物反應器時，強化的設計減少了需使用這些試劑進行處理的體積，從而減少了其用量。這點對于Benzonase這種昂貴的試劑來說尤為重要。 DSP：固定床生物反應器本身可作為一個過濾器，因此，根據(jù)工藝的不同，其可截留大部分的細胞或細胞碎片，從而使進入純化階段的料液整體上更干凈，降低過濾器的尺寸。此外，對于細胞內(nèi)產(chǎn)物，培養(yǎng)基來源(外部培養(yǎng)基罐)和細胞的位置(scale-X生物反應器)是分離的，這意味著需要處理的整體體積可以大大減少 - 從1,000L到~100L (包括漂洗)。對于細胞外產(chǎn)物，當scale-X與TFF系統(tǒng)鏈接時，可以實現(xiàn)類似的效果，其可使產(chǎn)物在生產(chǎn)時被濃縮，從而降低DSP中需處理的體積，繼而降低工藝時間。 |
降低工藝時間、操作占地和產(chǎn)品成本 |
6. 技術創(chuàng)新賦能生物制造的下一個變革
本文強調(diào)了GT制造面臨的一些挑戰(zhàn)，包括產(chǎn)能限制、靈活性、工藝平臺化以及產(chǎn)品成本。本文還顯示，使用目前市面上的技術，工藝由技術定義，例如，填充床生物反應器和細胞工廠用于貼壁細胞培養(yǎng)，而STR用于懸浮細胞培養(yǎng)。此外，跨技術的工藝轉移會導致產(chǎn)量的顯著下降。
本文的其它見解包括規(guī)模和處理體積之間的權衡，因為填充床生物反應器的處理體積和生產(chǎn)能力較低。而另一方面，STR可提供高達2000L的產(chǎn)能，但產(chǎn)生的大體積可能會導致中游工藝的瓶頸。此外，對于年需求量非常大的產(chǎn)品，即使是2000 L的STR也不能滿足產(chǎn)能需求。
圖11操作基于Nevoline工藝的潔凈室示意圖，包括種子擴增、細胞培養(yǎng)、病毒生產(chǎn)和澄清序列，總占地面積為30m2。
技術創(chuàng)新為上述挑戰(zhàn)提供了解決方案。本文證明了新型結構化固定床生物反應器可以使工藝與技術脫鉤，即其可用于懸浮和貼壁細胞工藝。對于GT開發(fā)商來說，這提供了一個獨特的機會，可以將工藝平臺化，輕松地使其適應可放大的技術，從而加快開發(fā)進度，并降低成本。對于CDMO來說，這也提供了一個獨特的機會，可通過采用兩用技術，提高潔凈室的利用率。此外，與其它可放大技術相比，結構化固定床設計可以提高懸浮工藝和貼壁工藝的特異性細胞產(chǎn)率。
當這些結構化固定床生物反應器與整合式連續(xù)生產(chǎn)的自動化技術相結合時，處理體積可從1000L降低到<100 L，消除了中游工藝的瓶頸。
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