胃腸道組織中含有最多的內(nèi)分泌細(xì)胞，許多胃腸激素在葡萄糖以及脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。5-hydroxytryptamine (5-HT，5-羥色胺)是最常見的胃腸激素，發(fā)揮中樞和外周功能。90%以上的5-HT是由腸嗜鉻細(xì)胞合成并釋放出來的。Tryptophan hydroxylase（TPH，色氨酸羥化酶）是5-HT起始合成以及限速的關(guān)鍵催化酶。近期的研究表明：外周5-HT能夠促進(jìn)白色脂肪組織的脂肪生成，抑制棕色脂肪組織的適應(yīng)性熱生成。在小鼠中通過基因沉默或藥物抑制5-HT的合成關(guān)鍵酶TPH1能夠使得小鼠對飲食誘導(dǎo)的肥胖以及葡萄糖不耐受產(chǎn)生抵抗。提示了外周5-HT是脂代謝和全身能量平衡的重要調(diào)節(jié)因子。

ZnT8是一種在胰島β細(xì)胞中富集的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，與1型和2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。然而，ZnT8在系統(tǒng)能量代謝中的確切作用及其作用機(jī)制仍知之甚少。19年發(fā)表在Diabetes上的一項(xiàng)研究通過建立ZnT8基因敲除小鼠，來探討ZnT8在小鼠體內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)代謝的機(jī)制。作者首先在小鼠身上發(fā)現(xiàn)了ZnT8敲除誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累，在小鼠的血液和組織中通過一系列生化檢測以及免疫染色，發(fā)現(xiàn)了ZnT8/TPH1/5-HT調(diào)節(jié)軸。進(jìn)一步地在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過siRNA敲低ZnT8驗(yàn)證了動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)ZnT8可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度而影響下游通路的改變。從這篇文章中，我們可以了解到基因敲除小鼠在代謝研究中的優(yōu)勢，由于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)無法觀察各個器官以及外周循環(huán)的代謝變化，因而這種優(yōu)勢是常規(guī)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所無法比擬的，并且更具說服力。

表型1：ZnT8基因敲除小鼠表現(xiàn)出脂肪的增加

首先，作者通過TALEN技術(shù)將C57BL/6N小鼠編碼ZnT8蛋白的Slc30a8基因敲除（該ZnT8基因敲除小鼠由賽業(yè)生物提供）。ZnT8敲除小鼠與野生型小鼠的形態(tài)以及生長趨勢相似。然而，雄性和雌性的ZnT8敲除小鼠均表現(xiàn)出脂體重增加，瘦體重下降的趨勢。白色脂肪組織WAT（包括附睪白色脂肪組織eWAT和皮下白色脂肪組織scWAT）也均顯著增加。而這種改變則是由脂肪細(xì)胞尺寸變大而引起的。

圖1. ZnT8敲除導(dǎo)致脂肪的增加

表型2：ZnT8敲除小鼠肝臟中的脂質(zhì)以及糖原的沉積增加

肝臟是脂質(zhì)代謝的一個重要器官，作者通過HE染色、油紅染色以及PAS染色法發(fā)現(xiàn)了ZnT8敲除小鼠的肝臟出現(xiàn)了脂質(zhì)以及糖原的沉積，并且肝臟中的甘油三酯水平顯著升高而總膽固醇未升高，以上數(shù)據(jù)表明了ZnT8的缺失會導(dǎo)致脂質(zhì)在脂肪組織和肝臟中堆積。

圖2. ZnT8敲除導(dǎo)致肝臟中脂質(zhì)和糖原的積累

機(jī)制：ZnT8在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)并調(diào)控外周的5-HT水平

由于胃腸道也是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要器官，作者發(fā)現(xiàn)ZnT8敲除小鼠的腸道明顯增厚，PCNA染色發(fā)現(xiàn)陽性染色的細(xì)胞明顯增加，表明了ZnT8缺失可促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖。接下來，作者通過免疫熒光染色檢查ZnT8是否在腸道中表達(dá)，以及其在腸道中的定位。作者發(fā)現(xiàn)ZnT8存在于腸道中的上皮層而不存在于平滑肌層或固有層。陽性染色細(xì)胞呈三角形，散布于結(jié)腸上皮細(xì)胞層內(nèi)。接著，作者將ZnT8抗體與腸內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物CgA以及其他腸道激素標(biāo)志物進(jìn)行共染色，觀察到ZnT8主要存在于CgA和5-HT陽性細(xì)胞。5-HT是最常見的胃腸激素，超過90%的循環(huán)系統(tǒng)中的5-HT都是由腸道合成并分泌出去的。

圖3. ZnT8在腸道中的表達(dá)及定位

值得注意的是，ZnT8敲除小鼠中的結(jié)腸的5-HT細(xì)胞的染色強(qiáng)度以及數(shù)量顯著增加，外周血清中的5-HT水平也顯著高于野生型小鼠。TPH1負(fù)責(zé)外周中的5-HT的合成，其在結(jié)腸中mRNA以及蛋白水平均顯著升高。上述的結(jié)果提示了ZnT8在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，特別是在5-HT陽性的腸嗜鉻內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，而ZnT8的缺失可以通過提高腸道中的TPH1的水平進(jìn)而促進(jìn)5-HT的合成并分泌到外周系統(tǒng)。

圖4. ZnT8敲除提高了小鼠TPH1的水平以及5-HT的合成分泌

為了進(jìn)一步探討ZnT8調(diào)節(jié)5-HT水平的機(jī)制，作者使用了RIN14B細(xì)胞作為體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停琑IN14B細(xì)胞是大鼠的一株δ細(xì)胞系，已被認(rèn)為是研究5-HT分泌的合適的細(xì)胞模型。作者在RIN14B中利用siRNA敲低ZnT8的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)TPH1的蛋白水平增加了近3倍。ELISA實(shí)驗(yàn)則表明，ZnT8敲低后，細(xì)胞裂解液以及培養(yǎng)基上清中的5-HT顯著增加。以上的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明了ZnT8的缺失增加了TPH1的表明進(jìn)而促進(jìn)5-HT的合成。由于ZnT8是介導(dǎo)鋅離子通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此作者想了解細(xì)胞鋅離子濃度的改變是否會影響TPH1和5-HT的水平。在培養(yǎng)基中添加了ZnSO4之后，顯著提高了TPH1和5-HT的水平。而添加鋅離子螯合劑TPEN去除鋅離子后則減弱了TPH1的mRNA和蛋白的表達(dá)，盡管對5-HT在培養(yǎng)基上清中的分泌沒有明顯的影響。以上的結(jié)果表明了ZnT8可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鋅離子濃度而影響TPH1的表達(dá)。

圖5. ZnT8通過調(diào)節(jié)鋅離子而影響TPH1的表達(dá)

總結(jié)

作者首先通過基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)了ZnT8缺失對于小鼠脂代謝的重要調(diào)節(jié)功能，在對小鼠體內(nèi)的表型以及機(jī)制進(jìn)行闡述之后，又利用體外的細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)加以輔證。整個研究可以歸納為：腸道內(nèi)分泌細(xì)胞中的ZnT8能夠調(diào)節(jié)TPH1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃腸激素5-HT的合成，5-HT分泌到外周系統(tǒng)，最后調(diào)節(jié)全身的脂質(zhì)代謝平衡。該文章充分利用賽業(yè)生物提供的ZnT8基因敲除小鼠的優(yōu)勢，將其成功應(yīng)用在脂質(zhì)代謝的研究中。

當(dāng)我們研究某個基因的調(diào)控功能時，如果能同時從動物模型及細(xì)胞模型得到驗(yàn)證，便可更加充分地證實(shí)其調(diào)控作用，提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)性，特別對于高分文章的發(fā)表，更為重要，此外同時構(gòu)建細(xì)胞模型和動物模型可節(jié)省時間，發(fā)文更快速。

賽業(yè)生物體內(nèi)體外一站式服務(wù)平臺

賽業(yè)生物長期致力于基因編輯細(xì)胞和動物模型的建立，擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的專家團(tuán)隊(duì)和成熟穩(wěn)定的技術(shù)平臺，客戶遍布全球幾十個國家和地區(qū)。我們可為客戶提供目的基因的表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞模型和動物模型，以及相關(guān)的表型檢測、功能驗(yàn)證、病理分析等一系列的服務(wù)，為廣大科研工作者提供便捷的服務(wù)。

KO細(xì)胞株+KO/cKO小鼠組合訂購，低至2.48萬！

賽業(yè)生物一站式服務(wù)平臺聯(lián)合推出細(xì)胞模型、動物模型基因編輯服務(wù)打包活動，基因敲除細(xì)胞株、基因敲除小鼠、條件性敲除小鼠任意搭配，低至2.48萬！從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，選賽業(yè)，不糾結(jié)！

原文檢索：

Zhuo M, Hui L, Wen S, et al. Deficiency of ZnT8 Promotes Adiposity and Metabolic Dysfunction by Increasing Peripheral Serotonin Production. Diabetes. 2019.

DOI: 10.2337/db18-1321