事情是這樣的，前幾天小編在家里葛優(yōu)躺的時(shí)候，收到了實(shí)驗(yàn)室?guī)煹艿男畔ⅰ?/span>

看完這麻煩師弟的問(wèn)題，我是一臉懵逼...... 這倆玩意兒不是一樣的么？

什么是移碼突變？

我們知道在mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程中，組成蛋白質(zhì)的氨基酸是由三個(gè)相鄰的堿基決定的，而mRNA的起始密碼子一般是AUG。當(dāng)翻譯開(kāi)始后，核糖體從AUG開(kāi)始翻譯，并且沿著mRNA進(jìn)行移動(dòng)，每相鄰的三個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸。

當(dāng)移碼突變發(fā)生時(shí)，在基因組上增加或減少了非3的倍數(shù)個(gè)堿基。這時(shí)候，蛋白翻譯依然從AUG起始密碼子開(kāi)始，但是由于增加或刪除的堿基破壞了原來(lái)基因序列，導(dǎo)致了表達(dá)的蛋白序列完全改變了，甚至引起蛋白翻譯提前結(jié)束。不管是哪種情況，原來(lái)的基因所表達(dá)的蛋白已經(jīng)不存在了，因此我們就可以認(rèn)為該基因已經(jīng)被敲除了。

那么，假如出現(xiàn)增加或刪減的堿基數(shù)是3的倍數(shù)這種情況呢？這種情況是不能算是移碼突變的。除非增加或刪減的堿基序列是在蛋白的關(guān)鍵功能域上，不然后續(xù)得到的蛋白依然有功能的，因此也就不能算是成功的基因敲除。理論上出現(xiàn)非移碼突變的概率是1/3，但是在做基因敲除的過(guò)程中，我們可以通過(guò)測(cè)序手段篩選出突變的序列為非3的倍數(shù)，從而確保得到陽(yáng)性克隆細(xì)胞是發(fā)生移碼突變的。

片段敲除又是什么？

片段敲除就很好理解了，也就是通過(guò)基因敲除手段，讓基因上的某個(gè)或某些外顯子區(qū)域缺失。在利用CRISRP/Cas9進(jìn)行片段敲除的過(guò)程中，我們會(huì)在要敲除的片段兩端設(shè)計(jì)兩條sgRNAs，然后通過(guò)Cas9蛋白對(duì)基因組進(jìn)行切割，從而達(dá)到敲除片段DNA的目的。

這時(shí)有同學(xué)會(huì)問(wèn)，只能敲除了某個(gè)外顯子，而不能敲除整個(gè)基因么？在技術(shù)上其實(shí)是可以做到的，但是整個(gè)基因片段的敲除比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且有時(shí)還可能讓你的結(jié)果非常不可信。首先，基因敲除的難度會(huì)隨著敲除片段長(zhǎng)度的增加而增加，一般基因包含的外顯子區(qū)都比較短，但內(nèi)含子區(qū)卻很大，從而導(dǎo)致了一個(gè)基因至少都有10Kb以上的序列，這時(shí)要敲除整個(gè)基因就會(huì)變得很困難。而且，在基因的內(nèi)含子區(qū)，往往并不是沒(méi)有功能基因序列，他們有可能包含著其他基因的調(diào)控元件，如果全部敲除就會(huì)影響其他基因的表達(dá)，甚至影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

移碼突變和片段敲除哪個(gè)更好？

細(xì)胞基因敲除策略，移碼突變和片段敲除沒(méi)有哪個(gè)是絕對(duì)的好與不好。對(duì)于大部分新手科研人員來(lái)說(shuō)，大量閱讀文獻(xiàn)，參考別人的實(shí)驗(yàn)思路是一門(mén)必修課。然而，在選擇移碼突變和片段敲除時(shí)，在已發(fā)表的文章中很少明確指出到底采用哪種策略進(jìn)行敲除。這說(shuō)明，在那些實(shí)驗(yàn)大牛的眼里，移碼突變和片段敲除只要能實(shí)現(xiàn)基因敲除就是好的方法策略。

例如，在這篇對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3的功能進(jìn)行研究的文章中，作者就用了移碼突變的方法，但是在實(shí)驗(yàn)方法那一欄就沒(méi)有明確指出是使用移碼突變還是片段敲除，只有從實(shí)驗(yàn)材料和數(shù)據(jù)中才能推斷出它使用的是移碼突變的敲除策略。

而下面這篇文章中，作者同時(shí)設(shè)計(jì)兩條sgRNAs對(duì)基因進(jìn)行小片段敲除，但也沒(méi)有明確指出使用的是片段敲除策略。

由此可以看出，這些實(shí)驗(yàn)大牛根本不會(huì)去糾結(jié)移碼突變和片段敲除哪個(gè)效果更好的問(wèn)題。

至此，本文對(duì)移碼突變和片段敲除的介紹就結(jié)束了。希望大家都能正確的認(rèn)識(shí)這兩者的區(qū)別，并得出自己的結(jié)論。

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