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基因基本信息

COL4A5基因研究概況

COL4A5是編碼IV型膠原蛋白的六個基因之一，這種蛋白膠原肽是細胞膜的重要基質(zhì)之一。該基因位于X染色體上，長度超過20萬個堿基對，屬于相對較大的基因。同時，其外顯子超過50個。該基因的突變有可能導(dǎo)致眼-耳-腎綜合癥，該疾病又被稱為Alport綜合癥。

該疾病是一種遺傳性膠原病，由于該基因位于X染色體上，因此遺傳與性別有關(guān)。3種編碼IV型膠原蛋白的基因發(fā)生改變都有可能造成該疾病的發(fā)生，它們分別是編碼α3、α4和α5鏈的COL4A3、COL4A4和COL4A5。這些蛋白的突變會導(dǎo)致基底膜發(fā)生病變，其中腎臟受損最為明顯，表現(xiàn)為尿血、蛋白尿和腎功能進行性下降；其次常伴有神經(jīng)性聽力下降和視覺異常，這是由于患者不同氣管膠原結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致。這三種基因共同在人群中有1/10 000～1/5000的致病突變攜帶率。

圖1. Alport綜合癥，信息來源：https://kidneyfailuretreatment.in/alport-syndrome/.

雖然COL4A3和COL4A4都會引起Aloport綜合癥，但是，由這兩個基因突變引起的Aloport綜合癥比例只有20%，大部分Alport綜合癥都是由于COL4A5基因突變造成的。其中，涉及到外顯子的突變中有接近一半是錯義突變，另外有1/4是移碼突變，此外還有少量的無義突變和剪切位點突變，其中無義突變和移碼突變引起的病情最重，發(fā)病也一般較早。通過對該基因外顯子突變與臨床信息的關(guān)聯(lián)來看，該基因外顯子發(fā)生突變會有超過70%的致病概率，如果把一些大概率致病的突變也加入進來，則突變致病的概率為84%。

圖2. COL4A5與Alport綜合癥。信息來源：Clinvar.

2019年，日本實驗室構(gòu)建了最新的Alport疾病模型，用同源重組的方法將含有人類相應(yīng)突變（R471X）附近的序列通過sgRNA引導(dǎo)，Cas9切割，ssODN（含突變位點）進行修復(fù)等一系列的過程構(gòu)建了無義突變的小鼠。造成該蛋白無法表達。對尿液的檢測發(fā)現(xiàn)R471X小鼠的蛋白和肌酐水平顯著高于正常組；血液中總蛋白沒有顯著差異，但是血液中的尿氮和尿肌酐出現(xiàn)明顯的提升。對6周大的小鼠進行免疫組實驗化也發(fā)現(xiàn)了R471X小鼠的腎小管纖維化。

圖3. COL4A5敲除小鼠的構(gòu)建。引自：Hashikami et al. 2019。

圖4. COL4A5敲除小鼠模型的表型。引自：Hashikami et al. 2019.

第二年，同一個實驗室利用反義寡核苷酸（antisense-oligonucleotide, ASO）對上述模型（R471X）進行了治療，原理是通過阻止21號外顯子的翻譯，讓20號和22號外顯子直接相連，跳過無義突變的區(qū)域。從小鼠4周齡開始，4-6周每周兩次皮下注射，7-20周每周注射一次。結(jié)果顯示經(jīng)過ASO治療的小鼠的生存狀態(tài)大大好于R471X小鼠，完全達到了野生型的水平。在體重沒有明顯區(qū)別的情況下，其尿蛋白/尿肌酐水平大大降低，同時血液中的各項指標(biāo)也幾乎恢復(fù)到了野生型小鼠的水平。

圖5. 外顯子跳躍示意圖。引自：Yamamura et al. 2020.

圖6. 經(jīng)過ASO治療的小鼠的生存狀態(tài)大大好于R471X小鼠，完全達到了野生型的水平。引自：Yamamura et al. 2020.

圖7. 經(jīng)過ASO治療的小鼠和R471X小鼠表型指標(biāo)。引自：Yamamura et al. 2020.

COL4A5作為X染色體連鎖Alport綜合癥的主要致病基因，一方面需要加強大眾對該疾病的認識，有相關(guān)癥狀的父母需要進行診斷及家族病史追蹤，確認是否為該疾病的攜帶者；另一方面也需要基因測序的成本繼續(xù)降低，才能讓更多的人從源頭上避免該類疾病的發(fā)生；此外，即便確診了疾病，目前基因治療技術(shù)的發(fā)展也讓我們不再對Alport綜合癥完全束手無策，至少看到了值得為之努力的方向。

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在過去的幾十年里，基因治療在治療遺傳性疾病方面取得了重大進展。以基因組學(xué)或蛋白組學(xué)的方式找到致病基因，再結(jié)合細胞水平或動物水平驗證，用這種模式產(chǎn)出的高質(zhì)量文章層出不窮。

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推薦文獻：

1. Hashikami K, Asahina M, Nozu K, Iijima K, Nagata M, Takeyama M. Establishment of X-linked Alport syndrome model mice with a Col4a5 R471X mutation. Biochem Biophys Rep. 2018;17:81-86. Published 2018 Dec 12. doi:10.1016/j.bbrep.2018.12.003

2. Yamamura T, Horinouchi T, Adachi T, Terakawa M, Takaoka Y, Omachi K, Takasato M, Takaishi K, Shoji T, Onishi Y, Kanazawa Y, Koizumi M, Tomono Y, Sugano A, Shono A, Minamikawa S, Nagano C, Sakakibara N, Ishiko S, Aoto Y, Kamura M, Harita Y, Miura K, Kanda S, Morisada N, Rossanti R, Ye MJ, Nozu Y, Matsuo M, Kai H, Iijima K, Nozu K. Development of an exon skipping therapy for X-linked Alport syndrome with truncating variants in COL4A5. Nat Commun. 2020 Jun 2;11(1):2777. doi: 10.1038/s41467-020-16605-x. PMID: 32488001; PMCID: PMC7265383.

3. Nozu K, Takaoka Y, Kai H, Takasato M, Yabuuchi K, Yamamura T, Horinouchi T, Sakakibara N, Ninchoji T, Nagano C, Iijima K. Genetic background, recent advances in molecular biology, and development of novel therapy in Alport syndrome. Kidney Res Clin Pract. 2020 Dec 31;39(4):402-413. doi: 10.23876/j.krcp.20.111. PMID: 33214343; PMCID: PMC7771000.