西班牙國家基因組分析中心、巴塞羅那科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Biotechnology》發(fā)表題為Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects的文章，從檢測靈敏度、細(xì)胞檢出類型、時(shí)間和花費(fèi)成本等方面，對13種單細(xì)胞RNA測序技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)性比較。為研究人員根據(jù)自己的實(shí)際應(yīng)用的需求，選擇使用不同的單細(xì)胞RNA-seq方法提供了指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
研究人員將來自3個(gè)物種，5種類型（圖1左上）的細(xì)胞進(jìn)行混合后，平均分成13份，分別進(jìn)行不同方法的單細(xì)胞測序。這些樣本具有如下特征：

· 包含多種細(xì)胞類型；

· 某些細(xì)胞非常相似，基因表達(dá)只有細(xì)微的差異；

· 細(xì)胞具有可追蹤的標(biāo)志物；

· 包含不同物種的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
可以看出低通量plate-based的Quarts-seq2, CEL-seq2, Smart-seq2方法在靈敏度上還是遠(yuǎn)強(qiáng)于其他高通量的方法，其中Quarts-seq2對三種細(xì)胞類型的基因檢出都是最高的， CEL-seq2的表現(xiàn)僅次于Quarts-seq2，但是優(yōu)于其它方法。
 
Boxplots displaying the minimum, the first, second and third quantiles, and the maximum number of genes detected across the protocols, in down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells. Cell identities were defined by combining the clustering of each dataset and cell projection on to the reference.

對于標(biāo)記基因的檢測，不同的方法檢測結(jié)果大不相同，Quartz-seq2和Smart-seq2對所有細(xì)胞標(biāo)記基因都能檢測出高表達(dá)水平，說明這兩種方法具有更高的細(xì)胞類型識別能力。
  d, Average log(expression) values of cell-type-specific reference markers for down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells. e,Average log(expression) values of cell-type-specific reference markers for down-sampled (20,000) HEK293T cells, monocytes and B cells.

對于細(xì)胞圖譜項(xiàng)目，往往由于使用不同的測序方法會(huì)生成多套數(shù)據(jù)，文章還測試了先把所有數(shù)據(jù)整合在一起然后進(jìn)行聚類分析細(xì)胞類型，考察了數(shù)據(jù)整合分析的可行性。

 
Integration of sc/snRNA-seq methods. a–d, UMAP visualization of cells after integrating technologies for 18,034 human (a,b) and 7,902 mouse (c,d) cells. Cells are colored by cell type (a,c) and sc/snRNA-seq protocol (b,d). e,f, Barplots showing normalized and method-corrected (integrated) expression scores of cell-type-specific signatures for human HEK293T cells, monocytes, B cells (e), and mouse secretory and TA cells (f). Bars represent cells and colors methods. g,h, Evaluation of method integratability in human (g) and mouse (h) cells. Protocols are compared according to their ability to group cell types into clusters (after integration) and mix with other technologies within the same clusters. Points are colored by sequencing method.

 

這篇文章的信息量非常大，作者還提到了諸如Smart-seq2這樣的成本較高的單細(xì)胞測序方法，可以通過微縮化的方式去降低成本，這點(diǎn)在SPT Labtech的mosquito納升級液體工作站上可以完美實(shí)現(xiàn)。
 

通過體外轉(zhuǎn)錄方式擴(kuò)增cDNA比基于PCR的方法產(chǎn)生的PCR偏好性更小，這也解釋了CEL-seq2的在檢測靈敏度等方面都表現(xiàn)出的良好性能。
 

文章中使用的13種scRNA-seq方法包括 CEL-seq2、MARS-seq、Quartz-seq2、gmcSCRB-seq、Smart-seq2、ddSEQ、ICELL8、C1HT-small、C1HT-medium、Chromium、Chromium (sn)、Drop-seq、inDrop。這也是大家耳熟能詳?shù)膯渭?xì)胞測序方法。

值得一提的是文章中使用的CEL-seq2檢測方法，使用了mosquito進(jìn)行5倍微縮化的CEL-seq2單細(xì)胞cDNA合成，這也是德國馬克斯普朗克研究所優(yōu)化的CEL-Seq2 protocol（mCEL-seq2）。使用mosquito添加160nL裂解液和240nL RT mix，cDNA第一鏈合成僅在400nL體系內(nèi)進(jìn)行。
 

德國馬普所的自動(dòng)化CEL-Seq2流程，節(jié)省5倍成本

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