免疫組織化學（IHC）是確定組織切片上蛋白的存在與否及存在位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時靈敏度較免疫印跡法或ELISA等免疫測定方法低，但是它能觀察到整個組織的情況，同時可以檢測目的蛋白在組織中的表達位置。適用于評估癌癥等疾病的發(fā)展及治療情況。因此，從IHC獲得的信息結合顯微技術給廣大科研工作者提供了一幅“宏圖”，使來自其它方法的數據有據可依。

免疫細胞化學（ICC）技術則是IHC技術在細胞樣本中的應用，通過對懸浮/爬片細胞進行免疫染色，可以檢測到目標蛋白在細胞中的表達位置和含量等信息，更加直觀。

IHC和ICC染色是抗體識別靶抗原的過程。因為抗體與抗原的結合是高度特異的，因此，它只與組織切片或細胞樣本中相應的蛋白結合。應用顯色檢測法即能看到抗原—抗體反應，其顯色方法是將使用酶結合的抗體，在添加底物后，通過酶促反應在蛋白位點產生色素沉著。另外一種方法是直接使用熒光染料標記的抗體，將抗體識別與熒光顯色技術相結合，通過熒光顯微技術對樣本進行檢測，這種方法通常被叫做免疫熒光（IF）。結合目前先進的熒光顯微鏡成像技術，如激光共聚焦顯微鏡，IF可以得到檢測樣本的三維立體結構，更加形象直觀。

要實現可靠一致的實驗結果，對操作流程的優(yōu)化必不可少。IHC/ICC/IF的原理和實驗步驟大體相同，整體實驗流程如下圖所示。

免疫染色實驗流程圖

二．設計實驗  
 
1.實驗對照

實驗對照：在進行免疫組化染色時，必須證實組織內顯示的反應產物，確實是抗原與相應的特異性抗體反應所產生的。由于免疫組織化學染色中影響抗原、抗體和免疫反應的因素很多，因此對免疫組織化學染色結果的評價必須設置對照組才能做出正確的判斷。常用的對照組有以下幾種：

陽性對照：用已證實含用待測抗原的組織，與待檢標本做同樣處理后，進行免疫組化染色，結果應為陽性，稱為陽性對照。每次實驗都應做陽性對照，通過陽性對照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個步驟以及所用的試劑都合乎標準，染色方法可靠。特別是當待檢的標本為陰性結果時，陽性對照呈陽性反應，可排除待檢標本假陽性的可能。所以若預期染色結果是陰性時，就必須設陽性對照。

陰性對照：用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結果為陰性。陰性對照可證實組織內若不含靶抗原，就不應染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的“假陽性”結果。

空白對照：是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結果應為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質引起的非特異性顯色。

替代對照：用與第一抗體來源的同一動物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對照中用非免疫性的正常IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數進行對照染色。這可證明待檢切片中陽性結果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細胞內待檢抗原的特異性反應的結果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動物的免疫前血清做替代對照，也可用未經免疫的同種動物血清，即非免疫血清替代一抗。

吸收試驗對照：用過量已知相應的純化抗原與第一抗體反應，抗體結合點全部被抗原結合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內的抗原反應，故再做免疫組化染色時，結果應為陰性。

自身對照：用同一組織切片上與待檢抗原無關的其它結構做對照。陰性反應與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。但進行科研工作中，單純用這種對照是不科學的。必須增加如空白對照、替代對照等，才能使染色結果得到承認�，F代國際上發(fā)表文章，一般在免疫組化染色的同時，還須有Western blotting做相應蛋白質檢測的實驗結果加以證實。

好的開始是成功的一半，在實驗中尤其如此。一個好的實驗設計往往決定了實驗的成敗。在正式試驗開始前，最好設立一項小規(guī)模的預實驗，可以確定某個抗體（尤其是新抗體）的最佳使用條件�？梢越柚�此小型預實驗，解決操作流程中關鍵步驟的潛在問題，然后再開展規(guī)模較大的實驗，這樣不僅節(jié)省時間，還能減少試劑消耗。

一抗是免疫學實驗的關鍵成分，其性能可直接影響到數據量。能用于免疫印跡法（WB）檢測特異性條帶的抗體無法充分保證適用于IHC/ICC/IF等實驗。這是因為WB分析將蛋白置于容易導致還原/變性的惡劣條件中，使蛋白結構發(fā)生變化（失去3D結構，變?yōu)榫�性形式）。經驗證可用于WB的抗體識別表位，在IHC/ICC/IF實驗中，因為蛋白維持其天然狀態(tài)，則可能會被隱藏和/或被掩蓋。