泛素化是最普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。泛素通常與底物蛋白上的賴氨酸殘基連接，但也可以結(jié)合非賴氨酸殘基。以往的研究證明，賴氨酸殘基的泛素化在多個細胞和生物學(xué)過程中起著重要作用，但非賴氨酸殘基作為泛素化位點有何生理學(xué)意義，目前還知之甚少。

近日，海軍軍醫(yī)大學(xué)安華章教授和袁紅斌教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為“E3 ligase Nedd4l promotes antiviral innate immunity by catalyzing K29-linked cysteine ubiquitination of TRAF3”的論文，揭示了E3連接酶Nedd4l通過催化TRAF3中的K29連接的半胱氨酸泛素化來正向調(diào)控抗病毒免疫反應(yīng)。
 

Nedd4l調(diào)控了抗病毒先天免疫
Nedd4l（又稱Nedd4-2）是泛素連接酶Nedd4家族中的一員，屬于HECT型E3泛素連接酶。它最為人熟知的功能是對上皮細胞的鈉通道進行調(diào)控。在TGF-β信號通路中，Nedd4l下調(diào)了TGFβR1和Smad2以限制TGF-β信號傳導(dǎo)。

為了研究Nedd4l是否在抗病毒先天免疫中起作用，研究人員使用了自發(fā)突變的Nedd4l缺陷型小鼠模型。他們從小鼠中分離出原代腹膜巨噬細胞，然后利用水皰性口炎病毒（VSV）感染。通過ELISA分析和RT-qPCR分析，他們發(fā)現(xiàn)，Nedd4l的缺乏會破壞病毒誘導(dǎo)IFN-β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。

接下來，他們通過Nedd4l條件性基因敲除小鼠（由賽業(yè)生物提供）體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，骨髓中Nedd4l的缺乏并不影響主要免疫細胞群的發(fā)育。不過，Nedd4l的條件性缺失抑制了VSV誘導(dǎo)體內(nèi)IFN-β和IL-6的產(chǎn)生。與對照小鼠相比，基因敲除小鼠脾臟和肝臟中的VSV復(fù)制和病毒滴度（TCID50）升高，存活率大大降低（圖1）。這些結(jié)果表明，Nedd4l正向調(diào)控了巨噬細胞中I型干擾素和促炎性細胞因子的產(chǎn)生，對于體內(nèi)抗病毒先天免疫至關(guān)重要。
 

圖1. Nedd4l的條件性缺失抑制了體內(nèi)的抗病毒先天免疫。

Nedd4l直接與TRAF3相互作用
在感染VSV后，RIG-1樣受體（RLR）會激活I(lǐng)RF3、NF-κB和MAPK，誘導(dǎo)I型干擾素和促炎性細胞因子的產(chǎn)生。研究人員此次發(fā)現(xiàn)，Nedd4l的缺乏會抑制VSV誘導(dǎo)的IRF3磷酸化。通過進一步分析IRF3的上游分子，他們發(fā)現(xiàn)Nedd4l的缺乏減少了TRAF3/TBK1復(fù)合物的形成，而Nedd4l的過表達則增加了TRAF3與TBK1的結(jié)合。

為了闡明這背后的機制，他們研究了Nedd4l是否與MAVS、TRAF3或TBK1相互作用。通過免疫共沉淀等實驗，他們發(fā)現(xiàn)在這三個分子中，只有TRAF3與Nedd4l發(fā)生相互作用。GST pull-down實驗也證明了兩者之間的直接相互作用（圖2）。他們還進一步證明，Nedd4l通過其WW結(jié)構(gòu)域與TRAF3結(jié)合。
 

圖2. Nedd4l與TRAF3發(fā)生相互作用。

Nedd4l對TRAF3的半胱氨酸殘基進行泛素化
TRAF3的泛素化是病毒誘導(dǎo)TRAF3/TBK1復(fù)合物形成所必需的。由于Nedd4l與TRAF3存在相互作用，研究人員推測Nedd4l通過促進TRAF3的泛素化而增加TRAF3/TBK1復(fù)合物的形成。實驗證實，Nedd4l的缺乏降低了巨噬細胞中VSV感染誘導(dǎo)的TRAF3泛素化。之后，他們利用一系列帶有HA標(biāo)記的Ub突變體（K11R、K29R、K33R、K48R、K63R）來鑒定多聚泛素鏈形成所需的賴氨酸殘基。結(jié)果表明，僅K29突變破壞了Nedd4l介導(dǎo)的TRAF3泛素化，也就是說，Nedd4l直接催化了K29連接的TRAF3泛素化。

接下來，他們試圖在TRAF3中鑒定Nedd4l催化的泛素化位點。通過LC-MS/MS分析，他們意外發(fā)現(xiàn)在Nedd4l過表達的細胞中，兩個半胱氨酸殘基C56和C124的泛素化也增加了，這兩個殘基參與構(gòu)成了TRAF3中的RZ1和Z1鋅指。C56和C124的突變顯著降低了Nedd4l催化的K29連接的泛素化，表明C56和C124殘基是Nedd4l催化的泛素鏈所連接的泛素化位點（圖3）。后續(xù)的分析表明，RZ1和Z1鋅指的調(diào)節(jié)或破壞會增加TRAF3泛素化。
 

圖3. Nedd4l對TRAF3中的半胱氨酸殘基進行泛素化。

此外，TRAF3也被其他E3連接酶泛素化，比如cIAP1/2和HECTD3。于是研究人員又分析了Nedd4l是否影響TRAF3與其他E3連接酶之間的相互作用。他們發(fā)現(xiàn)，Nedd4l缺乏降低了TRAF3與cIAP1/2和HECTD3的相互作用，而過表達則促進了它們之間的相互作用。C56和C124突變則更有效地招募了TBK1以形成TRAF3/TBK1復(fù)合物，并增加了VSV誘導(dǎo)的IFN-β、IL-6和TNF-α 的mRNA表達，證明了半胱氨酸殘基在調(diào)控病毒誘導(dǎo)的先天免疫中很重要。

這項研究表明，Nedd4l通過催化TRAF3中K29連接的半胱氨酸殘基的泛素化來促進VSV和LPS誘導(dǎo)的I型干擾素產(chǎn)生。作者認為，這不僅表明Nedd4l是抗病毒先天免疫的關(guān)鍵調(diào)控因子，也表明TRAF3泛素化的調(diào)控環(huán)境比以前預(yù)期的要復(fù)雜得多。同時，這項研究也顯示了半胱氨酸泛素化在先天免疫中的重要性。

原文檢索：
Gao, P., Ma, X., Yuan, M. et al. E3 ligase Nedd4l promotes antiviral innate immunity by catalyzing K29-linked cysteine ubiquitination of TRAF3. Nat Commun 12, 1194 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21456-1.