圖1. 空間和時(shí)間分辨率在目前的腦機(jī)接口類型之間的差異^[5]

研究內(nèi)容
由賓夕法尼亞卡倫大學(xué)的D. Kacy Cullen科研團(tuán)隊(duì)在腦機(jī)接口研究中利用組織工程學(xué)方法制備“活電極”：作為工程化的神經(jīng)微組織（microtissue engineered neural network，微組織工程神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，μTENN），活電極通過與宿主神經(jīng)元形成突觸，為神經(jīng)靶細(xì)胞與腦表面之間的信號(hào)傳遞提供了天然的生物基質(zhì)。當(dāng)不再使用任何傳統(tǒng)無機(jī)電極材料（例如鉑、鎢、硅）至大腦表面時(shí)，全有機(jī)物的形式可改善慢性異物反應(yīng)，潛在地改善長期穩(wěn)定性（圖2J）。此外，這是一種新型的光控“活電極”：結(jié)合光遺傳學(xué)（Optogenetics，2010年被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認(rèn)為是近十年來的突破之一，近幾年更是諾獎(jiǎng)熱門），提供進(jìn)入深層神經(jīng)環(huán)路的途徑，而且病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在植入前僅限于μTENN神經(jīng)元，因此不受潛在的病毒傳遞風(fēng)險(xiǎn)。
 
“活電極”巧妙構(gòu)造——利用單向/雙向μTENN和光遺傳學(xué)提供神經(jīng)環(huán)路的輸入/輸出
圖2是“活電極”構(gòu)造的概念示意圖。μTENN構(gòu)造包括水凝膠微柱、神經(jīng)元培養(yǎng)物和細(xì)胞外基質(zhì)腔。（A）1：可定制的亞克力模具，用于制備微柱；2：模具虛線頂視圖表示外徑（外徑；中部）和內(nèi)徑（內(nèi)徑；頂部和底部）；3：將匹配內(nèi)徑的針插入模具中：4：瓊脂糖（藍(lán)色）在微柱中熔融：5：拆針拆模后取出微柱。（B）1：具有錐形井的3D打印模具；2：聚二甲基硅氧烷（PDMS）澆鑄的錐形井；3：分離的神經(jīng)元（綠色）在錐形井中離心形成球狀聚集體；4：24小時(shí)后聚集體相圖；5：72小時(shí)后共聚焦對聚集體成像結(jié)果（GFP標(biāo)記）。（C） 微柱（灰色）充滿細(xì)胞外膠原層粘連蛋白基質(zhì)（紅色）。然后將神經(jīng)元聚集體置于微柱末端并在體外培養(yǎng)生長。（D）用分離的神經(jīng)元得到早期μTENN對最終的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了有限的控制（E）。聚集體（F）表現(xiàn)出強(qiáng)大的軸突生長和更可控的結(jié)構(gòu)，具有離散的胞體區(qū)域（G）和神經(jīng)投射（H）。（I）左圖：可植入活電極的μTENN微柱外型尺寸；中間：單向突觸宿主神經(jīng)元（紫色），傳遞外部信號(hào)至目標(biāo)皮層區(qū)域；右：宿主神經(jīng)元突觸雙向μTENN，傳遞來自宿主皮層的活動(dòng)，可通過背側(cè)μTENN進(jìn)行監(jiān)測。（J） 作為可移植輸入/輸出通道的光遺傳學(xué)工程“活電極”。輸入：LED陣列（1）通過光學(xué)刺激一個(gè)單向的、通道視紫紅質(zhì)陽性μTENN（2）激活第四層神經(jīng)元（3）。輸出：第五層神經(jīng)元（4）突觸一個(gè)雙向μTENN（5）；傳遞神經(jīng)元的活動(dòng)被記錄于位于大腦表面的光電二極管陣列（6）。比例尺，100μm。

圖2. “活電極”構(gòu)造的概念示意圖^[7]
 

光刺激、鈣成像和光記錄
作為對“光控活電極”方法的概念驗(yàn)證，D. Kacy CullenCullen團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)“全光”范式，能夠在體外同時(shí)對μTENN聚集體進(jìn)行光遺傳學(xué)控制和光學(xué)監(jiān)測。用通道視紫紅質(zhì)-2（ChR2）轉(zhuǎn)導(dǎo)皮層神經(jīng)元聚集體以進(jìn)行基于光的神經(jīng)元激活（“輸入”），用遺傳編碼的熒光鈣reporter RCaMP1b通過AAV1轉(zhuǎn)導(dǎo)以進(jìn)行神經(jīng)元活動(dòng)的光學(xué)讀出（“輸出”）。
以下視頻顯示了大約6mm長的ChR2/RCaMP μTENN的聚合體，在光刺激/光記錄實(shí)驗(yàn)成像結(jié)果。右上角紅色箭頭表示在470nm處ChR2⁺聚集體（視野外）的光學(xué)刺激。脈沖光纖輸出功率分別為106、211、317、423、528和634 mW/mm²（視頻1-6）。RCaMP⁺熒光的增加可以看作是隨著脈沖強(qiáng)度的增加而增加。

106 mW/mm²

211 mW/mm²


317 mW/mm


423 mW/mm²


528 mW/mm²


634 mW/mm²

視頻1-6.  “活電極”μTENN光刺激/光記錄實(shí)驗(yàn)成像結(jié)果


生物相容、功能性“活電極”——常規(guī)免疫組化方法結(jié)合Visikol組織透明化
植入式神經(jīng)接口的基本設(shè)計(jì)目標(biāo)是維持體內(nèi)的長期功能^[3]�？赡苡龅降恼系K中最普遍的可以概括為對植入物的多模式、持續(xù)的排異反應(yīng)（foreign body response，F(xiàn)BR），隨著時(shí)間的推移，這種反應(yīng)會(huì)降低腦機(jī)接口的效能^[8]。FBR是一種對健康組織破壞和大腦中持續(xù)存在異物的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，植入物在大腦中的存在通常會(huì)引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都會(huì)以促炎狀態(tài)留在該區(qū)域，試圖消除異物^[9,10]。而文章中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞增生的標(biāo)記物染色顯示，只有適度的宿主炎癥反應(yīng)（圖3C）。

圖3顯示在小鼠腦內(nèi)植入μTENN 1周和1個(gè)月，組織透明化和切片免疫組織化學(xué)結(jié)果。其中，μTENN神經(jīng)元存活并維持預(yù)先形成的胞體-軸突結(jié)構(gòu)，其中GFP⁺/GCaMP⁺胞體主要定位于微柱終端并由軸突束跨越（圖6）。為了觀察植入1個(gè)月的炎癥反應(yīng)程度，對植入物組織切片進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（Iba-1，紅色）和星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，玫紅色）染色，顯示只有少量的宿主神經(jīng)炎癥反應(yīng)（圖6C）。在植入的背側(cè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量密集的GCaMP⁺胞體（圖6B），管腔內(nèi)的軸突和樹突橫跨微柱（圖6D）。觀察到背側(cè)聚集體沿腦表面或沿微柱進(jìn)一步擴(kuò)散，推測是由于細(xì)胞從聚集體遷移而增加與宿主組織的相互作用（圖6B）。在某些情況下，從腹側(cè)植入物的位置也有高達(dá)數(shù)毫米的神經(jīng)元遷移，盡管遷移的存在和程度因植入物而異�？偟膩碚f，在活體電極的腹側(cè)聚集體中有廣泛的神經(jīng)突起生長，并有結(jié)構(gòu)證據(jù)表明與宿主神經(jīng)元形成突觸（圖6E和F）。箭頭表示穿透宿主大腦的十個(gè)神經(jīng)突起和假定的突觸形成，虛線表示放大（F）。比例尺，100μm（A至C）、50μm（D和E）和10μm（F）。HST，Hochest。

圖3. μTENN免疫組化結(jié)果和Visikol組織透明化成像

簡便、高效的Visikol透明化方法
其中經(jīng)采用振動(dòng)切片的方式采集到的100-200um切片至2mm厚切片，均由Visikol透明化化，采用簡單的梯度脫水后，即可直接使用Visikol HISTO透明化試劑，2mm厚切片簡單浸泡4小時(shí)（Visikol HISTO-1、HISTO-2分別孵育2小時(shí)）即可成像，可解決由于組織光散射特性而限制對超過幾百微米深的神經(jīng)元成像觀察問題。Visikol HISTO試劑專為生物大樣品透明化而設(shè)計(jì)，適用于厚度超過1mm的樣品，且不需要去除細(xì)胞膜脂質(zhì)，因此保留了固有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（親脂性染料適用），兼容免疫染色，此外透明化結(jié)果可逆，可繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)組學(xué)研究。
 
目前Visikol系列產(chǎn)品，不僅有用于完整動(dòng)物組織的透明化試劑，還有可用于3D細(xì)胞培養(yǎng)模型透明化、動(dòng)物胎兒骨成像、以及植物樣本透明化等樣本，適用的樣本種類多，可應(yīng)對廣大科研工作者各類研究需求。目前Visikol透明化所有產(chǎn)品锘海均代理有售，歡迎垂詢！文末為Visikol透明化的小鼠卵巢樣本血管染色成像結(jié)果（內(nèi)皮細(xì)胞抗體CD31特異性染色）。




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