腸道是人體重要的消化吸收的場(chǎng)所，也是最大的免疫器官。腸道微生物組、免疫細(xì)胞和粘膜屏障共同筑成了腸道上皮的穩(wěn)態(tài)，是人體健康的重要防線之一。這里和大家一起精讀一篇發(fā)表在Journal of Experimental Medicine雜志上的文獻(xiàn)，該研究首次揭示了通過(guò)小腸上皮細(xì)胞（IEC）來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化（IEL，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞）的分子機(jī)制，此外，研究發(fā)現(xiàn)微生物群對(duì)于小腸中MHCII和PD-L1以及IEL的上皮分化至關(guān)重要。

 

小腸中，經(jīng)典CD4+ T細(xì)胞可分化為CD4+ CD8αα+上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithelial lymphocytes, IELs），但是它們周圍的小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）在其中的作用還不明確。近日，Dr. Moon帶領(lǐng)的韓國(guó)團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)：在小腸遠(yuǎn)端，IECs在微生物群和IFN-γ的刺激下能通過(guò)表達(dá)MHC II類分子和程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1），提供生態(tài)龕（niche）適應(yīng)信號(hào)，來(lái)促進(jìn)CD4+CD8αα+IELs（DP IELs）的分化。 這一研究結(jié)果發(fā)表在了Journal of Experimental Medicine雜志上[1]。

 

備注：下文中的SP表示CD4+單陽(yáng)性（single positive）細(xì)胞；DP表示CD4+CD8+ 雙陽(yáng)性（double positive）細(xì)胞。

 

IELs的分化需要IECs上MHC II的表達(dá)

為了探究IECs在DP IELs分化過(guò)程中起到了非典型APC的作用，研究者們分析了C57BL/6野生型小鼠小腸不同部位中，MHC II在IECs上的表達(dá)情況。一系列的流式實(shí)驗(yàn)、RNA-seq實(shí)驗(yàn)都顯示IECs在DP IELs分化過(guò)程中的作用與MHC II抗原呈遞相關(guān)。此外，為了弄清楚IECs表達(dá)的MHC II在DP IELs分化中的作用，研究者們使用了一種特異性在IECs中敲除了MHC II的小鼠（MHC II△IEC），并通過(guò)與MHC IIfl/fl對(duì)照組小鼠相比，證實(shí)了IELs的分化需要IECs上MHC II的表達(dá)（圖1G-H）。

圖1G-H. 流式（G）和免疫熒光實(shí)驗(yàn)（H）都顯示：與MHC IIfl/fl對(duì)照組小鼠相比，MHC II△IEC小鼠的DP IELs在SP IELs細(xì)胞中的比例顯著下降。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)（H）顯示，大部分DP IELs都與高表達(dá)MHC II的上皮細(xì)胞的基底外側(cè)面相接觸。

 

MHC II在IECs上的表達(dá)依賴于IFN-γ的存在

有報(bào)道顯示IFN-γ在非造血細(xì)胞（例如IECs）中能強(qiáng)效誘導(dǎo)MHC II的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論，研究者們使用了一款I(lǐng)FN-γ受體敲除小鼠（IFN-γR−/−）。與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致：在IFN-γR−/−小鼠的IECs上，未檢測(cè)到MHC II的表達(dá)，而且DP IELs分化嚴(yán)重受阻，其在SP T細(xì)胞中的比例幾乎為0（圖2A）；在野生型小鼠中，加入anti-IFN-γ抗體后，MHC II的表達(dá)水平以及DP在SP IELs細(xì)胞中的比例都顯著降低（圖2B）。此外，有報(bào)道顯示IFN-γ是DP IELs分化所必需的：它能通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，促進(jìn)DP IELs的分化。這說(shuō)明IFN-γ在DP IELs的功能成熟中起到了重要作用。

圖2A-B. IFN-γ在非造血細(xì)胞（例如IECs）中能強(qiáng)效誘導(dǎo)MHC II的表達(dá)。

 

為了探究IELs和IECs中，IFN-γ對(duì)DP IELs分化的影響，研究者們構(gòu)建了骨髓（Bone marrow，BM）嵌合體小鼠：從供體小鼠的腿骨中取得BM細(xì)胞，靜脈注射到經(jīng)致死劑量輻照后的受體小鼠體內(nèi)（供體小鼠的造血細(xì)胞→受體小鼠），8周造血重建期過(guò)后處死受體小鼠。結(jié)果顯示（圖2C）：無(wú)論是在造血細(xì)胞（例如CD4+IELs），還是非造血細(xì)胞（例如IECs）中，DP IELs的分化都需要完整的IFN-γR信號(hào)。此外，之前在野生型小鼠中觀察到的不同小腸部位中MHC II表達(dá)量和DP IELs比例的明顯差異，在BM嵌合型小鼠中都未能觀測(cè)到。研究者們推測(cè)這有可能是因?yàn)槊庖咧亟ê蟮氖荏w小鼠比穩(wěn)態(tài)時(shí)產(chǎn)生了更多的IFN-γ，而這改變了腸道微環(huán)境，使其炎癥化，因此消除了這種區(qū)域性差異。

圖2C. DP IELs的分化需要完整的IFN-γR信號(hào)。

 

為了直接探究MHC II+IECs是否在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，研究者們構(gòu)建了分別來(lái)源于IFN-γR+/+小鼠和IFN-γR−/−小鼠的小腸類器官（orgnoids）。他們首先驗(yàn)證了IFN-γ在類器官中能發(fā)揮與體內(nèi)一致的效果：IFN-γ能強(qiáng)效誘導(dǎo)類器官中IECs上MHC II的表達(dá)（圖2D-E）。此外，有研究顯示，T-box expressed in T cells （T-bet）是DP IELs分化過(guò)程中的重要上游調(diào)控因子，它能誘導(dǎo)Runx3的表達(dá)并抑制ThPOK 的表達(dá)；而T-bet誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子（例如IFN-γ）在腸道微環(huán)境刺激因子的存在下，能進(jìn)一步促進(jìn)DP IELs的分化。因此，研究者們?cè)谀c道微環(huán)境刺激因子TGF-β和視黃酸（Retinoic acid,RA）存在的情況下，將經(jīng)IFN-γ和卵清白蛋白多肽（ovalbumin peptide，OVAp）預(yù)刺激后的小腸類器官，以及經(jīng)anti-CD3ε/CD28預(yù)刺激后的OVA特異性CD4+ T細(xì)胞（OT-II）進(jìn)行24h共培養(yǎng)（圖2F）。結(jié)果顯示：IFN-γ能誘導(dǎo)MHC II大量表達(dá)；MHC II+IECs在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，且TGF-β和RA刺激能進(jìn)一步促進(jìn)DP IELs的分化。

圖2D-E. 流式（D）和免疫熒光實(shí)驗(yàn)（E）顯示：進(jìn)行IFN-γ刺激后，IFN-γR+/+小鼠來(lái)源的類器官IECs上的MHC II表達(dá)水平顯著升高，而IFN-γR−/−小鼠來(lái)源的類器官IECs上的MHC II不表達(dá)。

 

圖2F-G. 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)示意圖（F）；IECs上MHC II的表達(dá)情況（G左）；DP在SP OT-II細(xì)胞中的比例（G右）。

 

IECs上經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的PD-L1在DP IELs分化中起到重要作用

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)知道MHC II+IECs能作為APC對(duì)CD4+IELs進(jìn)行同源刺激后，研究者們推測(cè)它們也能表達(dá)其他能與MHC II一起協(xié)同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的共受體。此外，由于MHC II在IECs上的表達(dá)依賴于IFN-γ的存在，研究者們進(jìn)一步推測(cè)這些共受體應(yīng)該與IECs中的IFN-γ信號(hào)有關(guān)。對(duì)經(jīng)IFN-γ處理或不處理的小腸類器官進(jìn)行RNA-seq分析，研究者們發(fā)現(xiàn)編碼PD-L1蛋白的Cd274基因與MHC II關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)顯著相關(guān)（圖3A-B）。類器官實(shí)驗(yàn)（圖3C）和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（圖3D-E）都表明IFN-γ能顯著影響PD-L1表達(dá)量。為了進(jìn)一步證實(shí)DP IELs分化需要IECs上PD-L1的表達(dá)，研究者們使用了PD-L1敲除小鼠（PD-L1−/−）、RAG-1敲除小鼠（RAG-1−/−，小鼠無(wú)成熟T、B細(xì)胞）、特異性在IECs中敲除了PD-L1目的基因的小鼠（PD-L1△IEC）以及由賽業(yè)生物構(gòu)建的PD-L1fl/fl對(duì)照組小鼠。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖F-H）都顯示IECs上的PD-L1在DP IELs分化中起到了重要作用。

圖3A-B. 差異表達(dá)基因熱圖（A）和火山圖（B）。

 

圖3C-E. （C）經(jīng)不同濃度IFN-γ處理后，小腸類器官PD-L1的表達(dá)量;（D）與IFN-γR+/+小鼠對(duì)比，IFN-γR−/−小鼠中的PD-L1表達(dá)量顯著降低；（E） 在IFN-γR+/+小鼠體內(nèi)注射anti-IFN-γ抗體后，IECs上PD-L1的表達(dá)量顯著降低。

 

圖3F-H. （F）與PD-L1+/+小鼠對(duì)比，在PD-L1−/−小鼠回腸中，DP IELs比例明顯下降；（G）將脾CD4+ T細(xì)胞輸入到RAG-1−/−小鼠體內(nèi)后，在小鼠體內(nèi)加入anti-PD-L1抗體，DP IELs發(fā)育受阻；（H）與PD-L1fl/fl小鼠對(duì)比，在PD-L1△IEC小鼠回腸中，DP IELs比例明顯下降。

 

微生物群對(duì)小腸中MHC II和PD-L1的表達(dá)以及DP IELs的分化至關(guān)重要

有報(bào)道顯示小腸中IFN-γ的產(chǎn)生以及IECs上MHC II的表達(dá)都需要微生物群，因此，為了探究IECs上PD-L1的表達(dá)是否受到微生物群調(diào)控，研究者們使用了無(wú)菌（Germ-free，GF）小鼠、無(wú)特定病原體級(jí)（specific pathogen–free，SPF） 小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：微生物群誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ能刺激IECs表達(dá)MHC II和PD-L1，而這兩者可以調(diào)節(jié)DP IELs的分化。

圖4A. 與SPF小鼠對(duì)比，GF小鼠IECs上PD-L1的表達(dá)水平在回腸中顯著降低、MHC II表達(dá)量和DP IELs比例在小腸各部位顯著下降，特別是在回腸中。

 

圖4B. 進(jìn)行抗生素處理后，SPF小鼠中IECs上PD-L1的表達(dá)水平在回腸中顯著降低、MHC II表達(dá)量和DP IELs比例在小腸各部位顯著下降，特別是在回腸中。

 

圖4C. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示：SPF小鼠回腸中的IECs大多數(shù)都表達(dá)MHC II，20%表達(dá)PD-L1；而GF小鼠中，MHC II和PD-L1的表達(dá)量都顯著降低。

 

PD-1信號(hào)通過(guò)抑制ThPOK表達(dá)來(lái)刺激DP IELs的分化

經(jīng)典CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞分別靠表達(dá)T helper–inducing POZ/Krüppel-like factor （ThPOK）和runt-related transcription factor 3 （Runx3）來(lái)維持自身譜系。因此，DP IELs的分化需要Runx3表達(dá)量的上調(diào)和ThPOK的缺失。此外，IECs上MHC II和PD-L1的表達(dá)都對(duì)DP IELs的分化至關(guān)重要，這表明TCR和PD-1釋放的信號(hào)可能參與了CD4+IECs的細(xì)胞重編程。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：T細(xì)胞內(nèi)源性的PD-1信號(hào)對(duì)DP IELs的分化是必需的（圖5A-C）。為了進(jìn)一步探究其中的分子機(jī)制，研究者們使用了ThPOK-GFP報(bào)告小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PD-1對(duì)ThPOK表達(dá)的抑制和DP IELs的分化需要PD-1信號(hào)的存在（圖5D-E）。此外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5G-I）顯示：PD-1信號(hào)通過(guò)經(jīng)典的Src homology 2 domain–containing tyrosine phosphatase （SHP） 通路來(lái)下調(diào)CD4+IECs中ThPOK的表達(dá)，從而促進(jìn)DP IELs的分化。

圖5A-C. （A）C57BL/6野生型小鼠中，PD-1在不同IEL亞群中的表達(dá)情況。當(dāng)SP IELs向DP IELs分化時(shí)，PD-1表達(dá)量下降。（B）與PD-L1+/+小鼠對(duì)比，在PD-L1−/−小鼠小腸中，DP IELs比例明顯下降。（C）將來(lái)自于PD-L1+/+小鼠和PD-L1−/−小鼠的脾CD4+ T細(xì)胞1:1混合后，移植到RAG-1−/−受體小鼠體內(nèi)。來(lái)源于PD-L1−/−CD4+ T細(xì)胞的DP IELs比例明顯降低。

 

圖5D-F. （D）實(shí)驗(yàn)示意圖：將來(lái)源于ThPOK-GFP報(bào)告小鼠的脾臟T細(xì)胞移植到RAG-1−/−受體小鼠體內(nèi)，并在重建期對(duì)受體小鼠進(jìn)行anti-PD-1抗體處理；（E）ThPOK和Runx3的表達(dá)水平；（F）DP IELs的比例。

 

圖5G-I. （G）將CD4+ T細(xì)胞和TGF-β、RA、PD-L1體外共培養(yǎng)3天后，測(cè)定ThPOKhi細(xì)胞比例。PD-L1介導(dǎo)了ThPOK的表達(dá)下調(diào)；（I-H） 將CD4+ T細(xì)胞和TGF-β、RA、PD-L1、SHP抑制劑（SHPi）體外共培養(yǎng)3天后，測(cè)定DP IELs的比例以及ThPOK和Runx3的表達(dá)水平。

 

綜上，在這篇文章中，研究者們發(fā)現(xiàn)IECs是腸道中促進(jìn)DP IELs分化的重要調(diào)控因素，起到了非典型APC的作用。腸道微生物群產(chǎn)生的IFN-γ可通過(guò)刺激IECs表達(dá)MHC II和PD-L1，對(duì)SP IELs提供TCR刺激和共受體信號(hào)，促進(jìn)其向DP IELs分化。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)不同生理位置的IECs的基因表達(dá)譜會(huì)有所區(qū)別，而這也會(huì)影響它們周圍的組織駐留型免疫細(xì)胞（例如DP IELs的分化）。

注：文中所有小鼠均為C57BL/6遺傳背景

 

人體腸道微生物基因組作為人類的第二套基因組，與人類健康密切相關(guān)。大量的研究表明腸道微生物與包括心血管、腫瘤、免疫、神經(jīng)、消化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其因果關(guān)系也在逐步闡明中。