實驗方案設(shè)計的第一步就是設(shè)置對照組，如何保證實驗操作的可行性以及實驗結(jié)果的可靠性，設(shè)置合理的對照組是關(guān)鍵。特別是陰性對照，不同的實驗類型陰性對照都包括好幾種，分分鐘讓你暈頭轉(zhuǎn)向，今天我們就來說說流式實驗的陰性對照。

 

 

我們都知道流式實驗是利用流式細(xì)胞儀激發(fā)細(xì)胞上結(jié)合的熒光素發(fā)射熒光，進(jìn)一步通過對熒光信號的分析就可以間接反映樣品細(xì)胞的物理化學(xué)特征。但是產(chǎn)生的熒光都是靶標(biāo)特異性的嗎？當(dāng)然不是。發(fā)射熒光不僅熒光素能夠在激光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，細(xì)胞表面的某些分子或者結(jié)構(gòu)也能夠產(chǎn)生類光，這種熒光相對于熒光素產(chǎn)生的熒光較弱，而且與細(xì)胞表面的特異抗原分子沒有相關(guān)性，被稱為非特異性熒光。在特定的激光激發(fā)下，細(xì)胞表面不結(jié)合流式熒光素時也會產(chǎn)生熒光信號。

 

通常地，每一種細(xì)胞都會產(chǎn)生非特異性熒光，流式檢測時得到的熒光信號是細(xì)胞本身的非特異性熒光和來自于細(xì)胞表面結(jié)合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結(jié)果。所以分析流式結(jié)果時，不能因為得到了熒光信號就判斷細(xì)胞表面肯定結(jié)合有相應(yīng)的熒光素，從而得出細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的抗原分子的結(jié)論，而應(yīng)該比較該熒光信號與細(xì)胞的非特異性熒光，如果得到的熒光信號大于非特異性熒光，說明得到的熒光信號部分來源于熒光素的特異性熒光，就可以得出細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的抗原分子的結(jié)論。

 

所以，確定與熒光素?zé)o關(guān)的細(xì)胞自身的非特異性類光的強(qiáng)弱非常重要，而設(shè)立陰性對照就是為了確定細(xì)胞的非特異性熒光。

 

 

話不多說，看圖，如上圖這3類陰性對照是流式分析比較全面的陰性對照：

 

第1類“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯(lián)抗體時得到的熒光信號，因為沒有標(biāo)記任何類光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素?zé)o關(guān)，與細(xì)胞抗原分子CD69是否表達(dá)無關(guān)，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號；

 

第2類“抗CD69”表示的是用抗CD69抗體標(biāo)記樣品細(xì)胞后得到的類光信號，雖然抗CD69抗體能修與細(xì)胞表面的CD69抗原分子結(jié)合，但是抗CD9抗體沒有偶聯(lián)熒光素，所以得到的熒光信號也與細(xì)胞表面是否表達(dá)有CD69分子無關(guān)，得到的熒光信號代表的也只是細(xì)胞本身的非特異性熒光信號，這種對照用于排除抗體的干擾；

 

第3類“IgG1-PE”表示的是標(biāo)記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體IgG1類的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯(lián)的同型（isotype）對照抗體（IgG1-PE）后，得到的熒光信號，這種就屬于同型對照，其不能與細(xì)胞表面的CD69發(fā)生特異性結(jié)合，所以細(xì)胞表面不會結(jié)合有IgG1-PE，最后得到的熒光信號是代表細(xì)胞本身的非特異性熒光，不屬于PE熒光素產(chǎn)生的特異性熒光信號，這種同型對照用于排除熒光素的干擾。

 

以上3種陰性對照，并不用全部設(shè)置齊全，一般只需要設(shè)置1種陰性對照就可以，其中第3種同型對照是最常規(guī)的陰性對照設(shè)置法。

 

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