想獲得國自然選題思路，提高國自然基金申請命中率？想調(diào)整研究方向，獲得學術(shù)研究突破口？有機會發(fā)高分文章？你需要了解學科發(fā)展態(tài)勢和未來走向！賽業(yè)生物專欄《Gene of the Week》每周會根據(jù)熱點研究領域介紹一個基因，詳細為您介紹基因基本信息、研究概況和應用背景等，助您保持學術(shù)研究敏銳度，提高科學研究效率，期待您的持續(xù)關(guān)注哦。今天我們要講的主角是經(jīng)典的免疫檢查點蛋白——CTLA-4。

CTLA-4（細胞毒性T淋巴細胞抗原4；也稱為CD152）是免疫球蛋白家族的成員，在小鼠體內(nèi)是由Ctla-4基因編碼，在人體內(nèi)是由CTLA4基因編碼的一種跨膜蛋白，主要表達在活化T細胞表面，特別的是，它在調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）中組成型表達。

CTLA-4與上周我們提到的CD28具有高度同源性，而且它們有著相同的配體CD80（也稱為B7-1）和CD86（也稱為B7-2），但是它們的功能截然相反。CD28屬于共刺激性（co-stimulatory）免疫檢查點，負責向T細胞傳遞激活信號，促進T細胞分化、增殖為效應細胞；CTLA-4屬于共抑制性（co-inhibitory）免疫檢查點，負責向T細胞傳遞抑制信號，抑制T細胞的活性。特別的是，CTLA-4與CD80/CD86的親和力更高，可競爭和阻斷CD28對T細胞的激活作用（圖1）。除此之外，與共抑制性免疫檢查點PD-1不同（腫瘤細胞會通過高表達其配體PD-L1和PD-L2來實現(xiàn)免疫逃逸），CTLA-4的配體CD80/CD86主要表達在APC表面，而在多數(shù)的腫瘤組織及細胞中低表達或不表達。

圖1. CTLA-4是一種跨膜蛋白[1]，它與CD28有相同的配體CD80（B7-1）和CD86（B7-2）。CTLA-4與CD80/CD86的親和力更高，可競爭和阻斷CD28和其配體的結(jié)合，從而抑制CD28對T細胞的激活作用。

作為一個經(jīng)典的免疫檢查點蛋白，靶向CTLA-4的抗體藥物研究十分熱門。但是，目前美國FDA批準上市的CTLA-4免疫檢查點抑制劑只有一種：Ipilimumab（伊匹單抗，商品名Yervoy，也稱為Y藥），由百時美施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司研發(fā)，用于治療晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。

此外，值得一提的是目前還有一款由阿斯利康（AstraZeneca）公司研發(fā)的靶向CTLA-4的候選藥物：Tremelimumab（替西木單抗）。這款候選藥物的臨床研究進展異常曲折：2015年由FDA授予治療惡性間皮瘤（malignant mesothelioma，MM）的孤兒藥地位；2017年宣布III期臨床研究MYSTIC失�。�2019年宣布III期臨床研究NEPTUNE失�。�2020年2月又由FDA授予治療肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）的孤兒藥資格; 同年3月又宣布另一項III期臨床研究DANUBE失敗。由衷希望2021年能聽到一些好消息，為腫瘤患者們帶來新希望。

除此以外，近期，目前流行的CTLA-4免疫抑制劑作用機制也受到了挑戰(zhàn)（圖2）。2018年，美國馬里蘭大學的Yang Liu教授和Zheng Pan教授團隊提出質(zhì)疑[2]： 抗CTLA-4抗體可能是通過由巨噬細胞介導的抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（Antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）或由NK細胞介導的抗體依賴的細胞毒性（Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）來選擇性的清除腫瘤細胞中的免疫抑制性的調(diào)節(jié)性T細胞（圖3）。

圖2. 目前流行的CTLA-4免疫抑制劑作用機制：阻斷CTLA-4免疫檢查點導致了抗腫瘤免疫效果。T細胞活化需要雙重信號。信號1來源于APC上的抗原-MHC復合物與T細胞上的TCR結(jié)合；信號2來源于APC上的B7分子（CD80或CD86）與T細胞上的共刺激性受體CD28結(jié)合�；罨�的T細胞上調(diào)其細胞表面CTLA-4的表達。而共抑制性受體CTLA-4與CD80/CD86的親和力更強，它與CD28競爭配體CD80/CD86，并抑制T細胞的活性，為T細胞的激活踩下“剎車”�？笴TLA-4抗體被認為松開了對初始T細胞的“剎車”，并準許它們在淋巴結(jié)中被激活，然后遷移到腫瘤部位對腫瘤細胞進行殺傷。

圖3. 新的CTLA-4免疫抑制劑作用機制：選擇性清除腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）導致了抗腫瘤免疫效果。腫瘤中調(diào)節(jié)性T細胞表達高水平的CTLA-4蛋白，因此抗CTLA-4抗體可能是通過由巨噬細胞介導的抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（Antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）或由NK細胞介導的抗體依賴的細胞毒性（Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）來選擇性的清除這些Treg。阻斷CTLA-4與其配體CD80/CD86的結(jié)合對有效清除腫瘤中的Treg來說并不是必需的。

綜上，CTLA-4蛋白在抑制T細胞活性中具有重要作用，針對它的免疫抑制劑是目前上市的三類免疫檢查點抑制劑之一（另外兩類是PD-1和PD-L1免疫檢查點抑制劑）。此外，這些藥物還在不斷擴大其適應癥，并與其他腫瘤免疫藥物進行聯(lián)用以提高療效（例如CTLA-4抗體與PD-1抗體聯(lián)合免疫療法、CTLA-4抗體與以IL-13Rα2為靶點的CAR-T細胞聯(lián)合免疫療法），但關(guān)于CTLA-4免疫抑制劑的具體作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] https://pdb101.rcsb.org/learn/structural-biology-highlights/tuning-immune-response-with-costimulation.

[2] Tang F., et al. Anti-CTLA-4 antibodies in cancer immunotherapy: selective depletion of intratumoral regulatory T cells or checkpoint blockade? Cell & Bioscience 8: 30 (2018).

賽業(yè)生物CTLA-4人源化小鼠，助力腫瘤研究

品系背景：C57BL/6N

品系構(gòu)建策略：

在小鼠基因組上的Ctla-4基因位點敲入人源CTLA-4胞外區(qū)域編碼序列，使其能夠表達：a）嵌合型Ctla-4蛋白（人源胞外結(jié)構(gòu)域和鼠源胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）和b）可溶性嵌合體蛋白（人源胞外結(jié)構(gòu)域）。

品系說明：

• CTLA-4基因的胞外域完全被人源化。
• hCTLA-4在小鼠體內(nèi)表達具有正常的生理表達和調(diào)節(jié)模式。
• 保留了小鼠CTLA-4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，保證了正常的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。
• 小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。
• 缺乏小鼠靶基因的表達，從而避免交叉反應。

研究應用：

hCTLA-4小鼠能夠在完全具有免疫能力的小鼠中進行針對人類免疫檢查點CTLA-4的免疫腫瘤學藥物的體內(nèi)療效評估和分析。您也可以委托賽業(yè)生物構(gòu)建條件性基因敲除CTLA-4小鼠對藥物的靶向性和毒性進行組織特異性評估。

模型驗證：

圖4. CTLA-4小鼠中各類免疫細胞（T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞、單核細胞）與WT小鼠的各類免疫細胞的比例接近，小鼠免疫細胞功能正常。

圖5. hCTLA-4的功能：α-human CTLA-4單抗下調(diào)，hCTLA-4小鼠Treg對效應T細胞的抑制。

用CFSE標記分離的CD4⁺CD25^-T細胞（效應T細胞），并用可溶性αmCD3和APC ^+/-（CD4⁺CD25⁺）Treg和CTLA-4抗體激活。（A）流式細胞術(shù)檢測CFSE稀釋；（B）通過ELISA在上清液中測定IL-2的產(chǎn)生。

圖6. hCTLA-4在hCTLA-4小鼠體內(nèi)的表達模式與野生型小鼠中mCTLA-4的表達模式一致。

hCTLA-4和mCTLA-4在αCD3活化的脾細胞表達情況。hCTLA-4小鼠模型和野生型小鼠上表達的（A）Treg亞群（CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)，（B）傳統(tǒng)CD4⁺（CD3⁺CD4⁺）和（C）CD8⁺（CD3⁺CD8⁺）T細胞。

圖7. 在CTLA-4人源化小鼠中，CTLA-4單抗（Ipilimumab）具有抗腫瘤活性。

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