摘要
為了提高體外皮膚組織模型的物理相關(guān)性和可翻譯性，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性是非常重要的。通過使用3D生物打印技術(shù)和合適的生物墨水，可以調(diào)節(jié)zhen皮和表皮的結(jié)構(gòu)并將細(xì)胞和材料精確地沉積在所需的位置。在本研究中，使用BIO X生物打印全厚度皮膚組織模型。zhen皮使用原代zhen皮成纖維細(xì)胞嵌入GelXA skin bioink進(jìn)行生物打印，表皮含有高濃度角質(zhì)形成細(xì)胞嵌入ColMA，沉積在zhen皮頂部。皮膚模型總共培養(yǎng)了14天，在開始?xì)庖航缑媾囵B(yǎng)的第6天和培養(yǎng)的第14天結(jié)束時收集了樣品。第1類人膠原蛋白（角蛋白14）的免疫熒光染色，角蛋白10和絲蛋白表明，所有標(biāo)記物的表達(dá)均隨時間增加。zhen皮中的膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)得到加強(qiáng)，并且表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞明顯地自我重組：隨著大量的絲聚蛋白向表皮的外層移動，在角質(zhì)形成細(xì)胞中角質(zhì)蛋白10急劇增加。這些結(jié)果表明，強(qiáng)健的皮膚組織模型可以通過3D生物打印來創(chuàng)建，從而驗(yàn)證了該技術(shù)在該領(lǐng)域的適用性。

引言
皮膚是我們與外部環(huán)境的第一個也是主要的界面，是極具吸引力的再生器官，并且在過去40年中科學(xué)家們對其進(jìn)行了大量探索（Loai，2019; Tarassoli，2017）。 部分原因是皮膚組織模型的廣泛應(yīng)用領(lǐng)域，從藥物篩選到化妝品測試以及傷口愈合研究，部分原因是皮膚組織的組成相對簡單，可以分為兩層，每層具有一類主要的細(xì)胞類型 這種簡單構(gòu)成意味著過去已經(jīng)建立幾個2D模型和培養(yǎng)系統(tǒng)。 但是，這些模型無法完全概括天然皮膚，并且缺乏3D模型提供的空間組織（Loai，2019; Singh，2020; Vijayavenkataraman，2016）。 為了增加物理相關(guān)性并增強(qiáng)體外結(jié)果與體內(nèi)條件的可翻譯性，迫切需要以3D方式調(diào)制皮膚組織模型。

在開發(fā)用于構(gòu)建3D皮膚模型的不同技術(shù)中，生物打印制造方法在克服與組織建模有關(guān)的挑戰(zhàn)方面已顯示出廣闊的前景（Pati，2016; Singh，2020），由于使研究人員能夠精確地模擬所需的結(jié)構(gòu)，并根據(jù)需要自由地結(jié)合不同的細(xì)胞和材料。 關(guān)鍵是要使用合適的基質(zhì)配方，以便打印出穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，支持細(xì)胞增殖和遷移，同時確保結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和機(jī)械完整性 (Tarassoli, 2017; Vijayavenkataraman, 2016)。
在3D生物打印中，天然和合成生物材料相結(jié)合形成可打印的生物墨水。 天然生物材料的好處是可以減輕環(huán)境對細(xì)的影響，而合成生物材料具有更好的機(jī)械性能（Murphy，2014年）。 3D生物打印中使用的兩種最常見的天然生物材料是明膠和膠原蛋白。 膠原蛋白是人體中最豐富的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的關(guān)鍵角色，可促進(jìn)出色的細(xì)胞通訊（Kular，2014年）。 但是，純膠原蛋白很難處理，因?yàn)楸仨殞⑵浔３衷?°C或酸性以避免固化。

明膠，源自膠原蛋白，所以保留了膠原蛋白的一些細(xì)胞特征，但具有在室溫下為固體而在體溫下為液體的化學(xué)優(yōu)勢。甲基丙烯酸明膠（GelMA）是一種可印刷的生物墨水，可在27°C下使用光進(jìn)行交聯(lián)，從而誘導(dǎo)甲基丙烯酸酯基團(tuán)之間形成共價鍵。 與甲基丙烯酸酯基團(tuán)的交聯(lián)性的相同特征也可以添加到膠原蛋白中。 但是，甲基丙烯酸膠原蛋白（ColMA）仍需要在4°C下處理以避免固化。 這項(xiàng)研究中使用的GelXA生物墨水是由CELLINK開發(fā)的基于GelMA的生物墨水配方，旨在擴(kuò)大GelMA的可印刷性范圍，并易于形成復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)。要了解有關(guān)不同生物材料和生物墨水特性的更多信息，請查看我們的生物墨水選擇指南手冊或訪問我們的網(wǎng)頁。
 
在這項(xiàng)研究中，我們旨在使用BIO X生物打印機(jī)打印出具有zhen皮和表皮的全厚度皮膚組織模型，GelXA SKIN生物墨水用于zhen皮，ColMA生物墨水用于表皮。在GelXA皮膚上，zhen皮的3D結(jié)構(gòu)被牢固地生物打印出來 ，而ColMA的固有特性可以形成薄而豐富的表皮層。 在zhen皮中，重點(diǎn)是評估ECM的產(chǎn)生，特別關(guān)注1型膠原的產(chǎn)生，因?yàn)樗�是天然zhen皮的主要蛋白質(zhì)。
 
對于表皮，選擇了三種分化標(biāo)記：用于增殖性角質(zhì)形成細(xì)胞的角蛋白14（K14），用于區(qū)分角質(zhì)形成細(xì)胞的角蛋白10（K10）和作為凝集層標(biāo)記的絲聚蛋白。 天然皮膚的表皮具有明確的分化過程，其中附著在zhen皮上的增生角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚最外層變成角質(zhì)細(xì)胞（角質(zhì)化角化細(xì)胞）（Eckhart，2013）。 在此角質(zhì)化過程的不同層中，表達(dá)了特異性分化標(biāo)記（圖1）。 為了評估表皮的發(fā)育，我們選擇評估指示標(biāo)記的表達(dá)。
 
材料和方法
細(xì)胞準(zhǔn)備
皮膚組織模型中使用了兩種細(xì)胞：少年正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDF，C-12300，PromoCell）和少年正常人皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（NHEK，C-12001，PromoCell）。 按照PromoCell的擴(kuò)增方案（NHDF，NHEK）對細(xì)胞進(jìn)行2D擴(kuò)增后再進(jìn)行生物打印，并分別用于第6-7代（NHDF）和第3代（NHEK）。 NHDFs在添加有生長培養(yǎng)基SupplementMix（C-39315，PromoCell）的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基（C-23010，PromoCell）中培養(yǎng)，而NHEK在PromoCell的角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基的發(fā)育配方中與培養(yǎng)基SupplementMix（C-97294， PromoCell）； 兩種培養(yǎng)基均添加了1％的抗生素-抗真菌藥（Gibco，100x）。

皮膚組織模型的生物打印
皮膚組織模型被設(shè)計(jì)為zhen皮籃，其實(shí)心底層上覆有兩個網(wǎng)格層和6層高帽檐（圖2）。 這是為了促進(jìn)種子后表皮的包裹。 用GelXA SKIN（CELLINK，Ref＃IK3X21110301）對皮膚籃子進(jìn)行生物打印。 簡而言之，收集了5.7 x 106 NHDF，旋轉(zhuǎn)并重組為250 µL細(xì)胞懸液，然后將其小心地混入2.5 mL GelXA SKIN中，預(yù)熱至37°C，然后轉(zhuǎn)移到琥珀色濾芯中（CELLINK，參考編號CSO010311502）。為了除去殘留的氣泡，將帶有嵌入式NHDF的GelXA SKIN濾芯在460G下離心1分鐘。 然后，在開始打印會話之前，將墨盒安裝在溫度控制的打印頭（CELLINK，參考號＃00000020346）上，然后在準(zhǔn)備好的BIO X生物打印機(jī)中溫度設(shè)置成24°C，持續(xù)10分鐘。
進(jìn)行該步驟需要將GelXA生物墨水的溫度平衡到24°C，這是適用于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的GelXA生物墨水的合適生物印刷溫度。

然后zhen皮籃在24°C下用溫控打印頭以4至5 mm / s的速度，20至40 kPa的壓力在12孔板中對進(jìn)行生物打印，并將BIO X的打印床設(shè)置為 14℃。 然后先用405 nm光固化模塊在高于構(gòu)造物5厘米處用405 nm光固化模塊將12個重復(fù)的zhen皮籃光固化15秒（每個構(gòu)造物），然后浸入交聯(lián)劑（CELLINK，參考號CL1010006001）中，并補(bǔ)充10 U / mL凝血酶5分鐘。 然后將皮籃用成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基洗滌一次，并在添加表皮之前與成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基孵育（37°C，5％CO2）1小時。 
  圖2.培養(yǎng)14天后的3D生物打印模型的示意圖，側(cè)視圖（左）和頂視圖（中）以及生物打印的皮膚組織模型的圖像（右）。

表皮的添加
對于表皮，使用ColMA（CELLINK，參考號IK4501022001）和NHEK的混合物。簡而言之，將12 x 10⁶ NHEK（每個皮膚籃1 x 10⁶）重構(gòu)為240 µL細(xì)胞懸液，并與240 µL ColMA（8 mg / mL，終濃度4 mg / mL）混合。將重構(gòu)的ColMA置于冰上，直到將其添加到zhen皮結(jié)構(gòu)中。從zhen皮籃中取出成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，并在每種zhen皮構(gòu)建體的頂部添加40 µL表皮生物墨水-細(xì)胞混合物。在光固化30秒（405nm，距構(gòu)建體5cm的距離）之前，將構(gòu)建體在臺式上放置15分鐘以沉降。然后將樣品以10G離心10秒，再光固化30秒。這是為了增強(qiáng)表皮和zhen皮之間的接觸。然后將皮膚組織模型浸沒在角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，并在37°C，5％CO₂下孵育6天，然后轉(zhuǎn)移至氣液界面培養(yǎng)物中。通過將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有合適體積的角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基的transwell插入物中來建立氣液界面（圖3）。每2至3天更新一次培養(yǎng)基。 
  圖3. A）生物打印的zhen皮籃子。 B）3D生物打印的皮膚組織模型轉(zhuǎn)移到Transwell插入物中。 C）從皮膚組織模型的浸沒培養(yǎng)到氣液界面培養(yǎng)的轉(zhuǎn)移的圖示。

分析
根據(jù)CELLINK的固定方案，在第6天（開始?xì)庖航缑妫┖偷?4天（實(shí)驗(yàn)結(jié)束）收集樣品，并在4％PFA中固定以進(jìn)行組織學(xué)染色。 然后將樣品包埋在石蠟中，并按照CELLINK的方案進(jìn)行切片。 他們對人類1型膠原蛋白（Atlas抗體，Ref＃HPA011795，未報(bào)道發(fā)現(xiàn)可檢測大鼠來源的ColMA），角蛋白10（Atlas抗體，Ref＃HPA012014），角蛋白14（Abcam，Ref＃ab7800）和絲蛋白（Atlas）染色 抗體，參考編號HPA030188），遵循CELLINK的免疫熒光染色方案，并使用Alexa Fluor 488（ThermoFisher，參考編號A-27034用于兔子，參考編號A-11029用于小鼠）作為第二抗體。 樣品還按照CELLINK的H＆E染色方案進(jìn)行了H＆E染色。 所有協(xié)議都可以在CELLINK的支持標(biāo)簽下的網(wǎng)頁上找到。
 
結(jié)果與討論
用于該皮膚組織模型的制造方法創(chuàng)建了完整且堅(jiān)固的構(gòu)造，該構(gòu)造在整個實(shí)驗(yàn)過程中保持其形狀。 樣品橫截面的H＆E染色最初顯示，兩個隔層（zhen皮和表皮）之間的連接較弱。 但是在第14天，這兩層已經(jīng)合并（圖4）。 在第14天，可以看到表皮平滑地沿著zhen皮的輪廓移動，并且角質(zhì)形成細(xì)胞開始重組。
    仔細(xì)觀察表皮的發(fā)育，免疫熒光圖像顯示整個培養(yǎng)過程中都保持了角蛋白14的表達(dá)，而在第14天角蛋白10和絲聚蛋白的表達(dá)均增加。 在表皮的中部，而角蛋白層（角質(zhì)層的標(biāo)記）應(yīng)在表皮的最外層。 角蛋白10和絲蛋白的表達(dá)明顯增加表明角質(zhì)形成細(xì)胞已經(jīng)開始分化。 在第14天，絲聚蛋白表達(dá)重新定位到構(gòu)建體的頂部，朝向氣-液界面，顯示了細(xì)胞在生物打印模型內(nèi)重組的能力。 
 
在14天的培養(yǎng)期內(nèi)，將構(gòu)建體在最初的6天中浸入水下培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移至氣液界面培養(yǎng)8天。 生物打印的皮膚組織模型顯示zhen皮和重組表皮中膠原蛋白的產(chǎn)生增加，傳統(tǒng)的分層分化模式開始形成。 穩(wěn)定的角蛋白14表達(dá)（表明存在增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞）表明，有可能擴(kuò)展模型的氣液界面培養(yǎng)，以進(jìn)一步成熟生物打印的皮膚構(gòu)造。

結(jié)論
這項(xiàng)研究舉例說明了如何使用原代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和CELLINK的3D生物打印平臺對全厚度的皮膚組織模型進(jìn)行3D生物打印。
➢ PromoCell的細(xì)胞和培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以創(chuàng)建全厚度皮膚組織模型。 在當(dāng)前模型中，細(xì)胞重組并增殖以形成更天然的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
➢ GelXA SKIN生物墨水為皮膚發(fā)育提供了良好的環(huán)境，基于ColMA的表皮生物墨水支持皮膚組織模型內(nèi)的表皮形成。
➢ 模型設(shè)計(jì)為表皮和zhen皮發(fā)育形成了一個強(qiáng)大的平臺，在14天的培養(yǎng)期內(nèi)保持穩(wěn)定，但可以培養(yǎng)更長的時間，以使其他zhen皮和表皮標(biāo)記物進(jìn)一步成熟。

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