1.需要用戶自己準備的耗材、儀器和試劑
a.具有FAM和VIC熒光通道的熒光定量PCR儀。
b.DNase-free、RNase-free的吸頭、離心管、熒光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
c.生物安全柜。
d.RNA提取試劑盒。
2.樣本準備
a.本試劑盒適用樣本類型:上呼吸道標本(包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液);下呼吸道標本(包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本);組織培養(yǎng)物等樣本。
b.樣本采集具體方法請參考“2019新型冠狀病毒核酸檢測專家共識”和“新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南”。
c.樣本采集后,可保存在病毒樣品常規(guī)保存液進行病毒的保存,并須當日完成檢測。否則按下述方案保存:2~8℃保存,不超過24小時;-20℃保存,不超過3個月;-70℃以下可長期保存,但應避免反復凍融。也可以使用病毒RNA穩(wěn)定保存液進行保存,室溫可以保存7天左右。
d.將樣品按照病毒RNA提取試劑盒中相應的要求和步驟進行RNA提取,提取的RNA可直接用于檢測。若提取后不立即檢測,也可保存于-70℃?zhèn)溆,同時應盡量避免反復凍融。
e.經(jīng)假病毒模擬驗證,本試劑盒也適用于保存于常規(guī)病毒保存液中的咽拭子、唾液等樣品的直接檢測,無須進行RNA的抽提。但實際操作時,須根據(jù)病毒樣本的來源、保存液類型進行一定的對比測試。對于保存在病毒RNA穩(wěn)定保存液的樣品,必須進行RNA抽提后才能使用本試劑盒進行檢測。不同數(shù)量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的各種病毒保存液(TE、PBS及含F(xiàn)BS和抗生素的HBSS)、細胞培養(yǎng)液(DMEM、1640,不含F(xiàn)BS)、RNA病毒直接qRT-PCR保存液中,未經(jīng)抽提直接使用本試劑盒進行qRT-PCR檢測的效果見下表。此處的病毒量為每個PCR反應體系中病毒的IU數(shù)。從下表數(shù)據(jù)可以看出,TE、PBS及常用的細胞培養(yǎng)液中保存的假病毒可以直接用于本試劑盒檢測,而 RNA病毒直接qRT-PCR保存液效果更佳。含有FBS的HBSS可能由于FBS的影響,Ct值會高出約2-3。
病毒保存液 | TE | PBS | HBSS + 2% FBS + 1% PS | |||||||||
病毒量(IU) | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 |
Ct平均值 | 25.46 | 26.43 | 27.73 | 28.44 | 25.51 | 26.40 | 27.50 | 28.42 | 27.58 | 28.57 | 29.38 | 30.38 |
標準偏差 | 0.096 | 0.157 | 0.420 | 0.122 | 0.069 | 0.015 | 0.081 | 0.259 | 0.156 | 0.054 | 0.040 | 0.174 |
病毒保存液 | DMEM | 1640 | BeyoDirect™ RNA病毒直接qRT-PCR保存液 | |||||||||
病毒量(IU) | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 |
Ct平均值 | 24.99 | 25.86 | 26.76 | 28.37 | 25.38 | 25.98 | 27.19 | 28.00 | 24.23 | 25.25 | 26.73 | 27.75 |
標準偏差 | 0.035 | 0.187 | 0.562 | 0.090 | 0.100 | 0.277 | 0.203 | 0.084 | 0.118 | 0.180 | 0.129 | 0.232 |
f.核酸檢測的各個步驟需要在指定區(qū)域進行,以避免交叉污染。例如樣本處理、加樣在樣本處理區(qū),擴增試劑準備在PCR前準備區(qū),核酸擴增在檢測區(qū)。
3.qRT-PCR反應體系的設置
a.融解并混勻反應所需的各種溶液,置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
參考下表在室溫或冰浴上設置qRT-PCR反應體系(以96孔板,每孔反應體系為25µl為例)。下表中的Template RNA為樣品RNA、試劑盒中提供的Negative Control或Positive Control。建議每次檢測都設置陰性對照(Negative control)和陽性對照(Positive control)。
Reagent | Volume |
Reaction Buffer | 17.5μl |
Enzyme Mix | 2.5μl |
Template RNA* | 5μl |
Total Volume | 25μl |
*注:實際操作時,如果經(jīng)驗證測試可免RNA抽提而直接檢測,則用RNA病毒樣本直接替代Template RNA。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻,室溫離心數(shù)秒,使液體積聚于管底。
d.將設置好的PCR反應管或PCR反應板置于熒光定量PCR儀上,開始PCR反應。
e.熒光檢測通道的選擇:ORF1ab基因熒光基團是VIC,可選擇檢測通道(Reporter)為VIC/HEX/JOE,淬滅基團(Quencher)是BHQ1,如果沒有BHQ1,則選擇無;N基因熒光基團是FAM,可選擇檢測通道為FAM,淬滅基團是TAMRA,如果沒有TAMRA,則選擇無。請將儀器的熒光內(nèi)參設置為“None”,例如:對于ABI系列儀器,將“Passive Reference”設置為“None”。
4.qRT-PCR反應程序
本試劑盒建議采用如下的qRT-PCR程序,本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex熒光定量PCR儀為例:
a.反轉(zhuǎn)錄:50℃ 20min
b.預變性:95℃ 2min
c.變性:95℃ 15sec
d.退火/延伸:60℃ 20sec
e.重復步驟c和步驟d,總共45個循環(huán)
f.最后使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析檢測結(jié)果。
5.結(jié)果的定性判斷
a.陽性對照:呈典型S型擴增曲線且Ct值≤33。
b.陰性對照:無典型S型擴增曲線或Ct值>38。
c.陽性:如果待測樣本檢測結(jié)果VIC通道和FAM通道均Ct值≤35,則可判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性。
d.陰性:如果兩個通道檢測Ct值無數(shù)值或Ct值>38,且陽性對照品檢測結(jié)果為陽性,此次結(jié)果判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陰性,但不排除其它冠狀病毒感染的可能。
e.可疑:如果待測樣本35<Ct值≤38,則此樣本應重新提取核酸后再次進行檢測。如重復檢測結(jié)果顯示兩個通道Ct值均≤35,則判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性;如兩個通道檢測Ct值無數(shù)值或Ct值>38,則判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陰性;如其中任一通道35<Ct值≤38,則該樣本為可疑樣本,應通過其它方法如測序進行進一步的分析和檢測。