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新型冠狀病毒(2019-nCoV)雙熒光qRT-PCR試劑盒使用說明

瀏覽次數(shù):4264 發(fā)布日期:2021-1-14  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

1.需要用戶自己準備的耗材、儀器和試劑
a.具有FAM和VIC熒光通道的熒光定量PCR儀。
b.DNase-free、RNase-free的吸頭、離心管、熒光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
c.生物安全柜。
d.RNA提取試劑盒。

 

2.樣本準備
a.本試劑盒適用樣本類型:上呼吸道標本(包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液);下呼吸道標本(包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本);組織培養(yǎng)物等樣本。
b.樣本采集具體方法請參考“2019新型冠狀病毒核酸檢測專家共識”和“新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南”。
c.樣本采集后,可保存在病毒樣品常規(guī)保存液進行病毒的保存,并須當日完成檢測。否則按下述方案保存:2~8℃保存,不超過24小時;-20℃保存,不超過3個月;-70℃以下可長期保存,但應避免反復凍融。也可以使用病毒RNA穩(wěn)定保存液進行保存,室溫可以保存7天左右。
d.將樣品按照病毒RNA提取試劑盒中相應的要求和步驟進行RNA提取,提取的RNA可直接用于檢測。若提取后不立即檢測,也可保存于-70℃?zhèn)溆,同時應盡量避免反復凍融。
e.經(jīng)假病毒模擬驗證,本試劑盒也適用于保存于常規(guī)病毒保存液中的咽拭子、唾液等樣品的直接檢測,無須進行RNA的抽提。但實際操作時,須根據(jù)病毒樣本的來源、保存液類型進行一定的對比測試。對于保存在病毒RNA穩(wěn)定保存液的樣品,必須進行RNA抽提后才能使用本試劑盒進行檢測。不同數(shù)量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的各種病毒保存液(TE、PBS及含F(xiàn)BS和抗生素的HBSS)、細胞培養(yǎng)液(DMEM、1640,不含F(xiàn)BS)、RNA病毒直接qRT-PCR保存液中,未經(jīng)抽提直接使用本試劑盒進行qRT-PCR檢測的效果見下表。此處的病毒量為每個PCR反應體系中病毒的IU數(shù)。從下表數(shù)據(jù)可以看出,TE、PBS及常用的細胞培養(yǎng)液中保存的假病毒可以直接用于本試劑盒檢測,而 RNA病毒直接qRT-PCR保存液效果更佳。含有FBS的HBSS可能由于FBS的影響,Ct值會高出約2-3。

 

病毒保存液 TE PBS HBSS + 2% FBS + 1% PS
病毒量(IU) 400 200 100 50 400 200 100 50 400 200 100 50
Ct平均值 25.46 26.43 27.73 28.44 25.51 26.40 27.50 28.42 27.58 28.57 29.38 30.38
標準偏差 0.096 0.157 0.420 0.122 0.069 0.015 0.081 0.259 0.156 0.054 0.040 0.174
 
病毒保存液 DMEM 1640 BeyoDirect™ RNA病毒直接qRT-PCR保存液
病毒量(IU) 400 200 100 50 400 200 100 50 400 200 100 50
Ct平均值 24.99 25.86 26.76 28.37 25.38 25.98 27.19 28.00 24.23 25.25 26.73 27.75
標準偏差 0.035 0.187 0.562 0.090 0.100 0.277 0.203 0.084 0.118 0.180 0.129 0.232

f.核酸檢測的各個步驟需要在指定區(qū)域進行,以避免交叉污染。例如樣本處理、加樣在樣本處理區(qū),擴增試劑準備在PCR前準備區(qū),核酸擴增在檢測區(qū)。

 

3.qRT-PCR反應體系的設置
a.融解并混勻反應所需的各種溶液,置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
參考下表在室溫或冰浴上設置qRT-PCR反應體系(以96孔板,每孔反應體系為25µl為例)。下表中的Template RNA為樣品RNA、試劑盒中提供的Negative Control或Positive Control。建議每次檢測都設置陰性對照(Negative control)和陽性對照(Positive control)。

Reagent Volume
Reaction Buffer 17.5μl
Enzyme Mix 2.5μl
Template RNA* 5μl
Total Volume 25μl

*注:實際操作時,如果經(jīng)驗證測試可免RNA抽提而直接檢測,則用RNA病毒樣本直接替代Template RNA。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻,室溫離心數(shù)秒,使液體積聚于管底。
d.將設置好的PCR反應管或PCR反應板置于熒光定量PCR儀上,開始PCR反應。
e.熒光檢測通道的選擇:ORF1ab基因熒光基團是VIC,可選擇檢測通道(Reporter)為VIC/HEX/JOE,淬滅基團(Quencher)是BHQ1,如果沒有BHQ1,則選擇無;N基因熒光基團是FAM,可選擇檢測通道為FAM,淬滅基團是TAMRA,如果沒有TAMRA,則選擇無。請將儀器的熒光內(nèi)參設置為“None”,例如:對于ABI系列儀器,將“Passive Reference”設置為“None”。

 

4.qRT-PCR反應程序
本試劑盒建議采用如下的qRT-PCR程序,本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex熒光定量PCR儀為例:
a.反轉(zhuǎn)錄:50℃ 20min
b.預變性:95℃ 2min
c.變性:95℃ 15sec
d.退火/延伸:60℃ 20sec
e.重復步驟c和步驟d,總共45個循環(huán)
f.最后使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析檢測結(jié)果。

 

5.結(jié)果的定性判斷
a.陽性對照:呈典型S型擴增曲線且Ct值≤33。
b.陰性對照:無典型S型擴增曲線或Ct值>38。
c.陽性:如果待測樣本檢測結(jié)果VIC通道和FAM通道均Ct值≤35,則可判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性。
d.陰性:如果兩個通道檢測Ct值無數(shù)值或Ct值>38,且陽性對照品檢測結(jié)果為陽性,此次結(jié)果判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陰性,但不排除其它冠狀病毒感染的可能。
e.可疑:如果待測樣本35<Ct值≤38,則此樣本應重新提取核酸后再次進行檢測。如重復檢測結(jié)果顯示兩個通道Ct值均≤35,則判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性;如兩個通道檢測Ct值無數(shù)值或Ct值>38,則判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陰性;如其中任一通道35<Ct值≤38,則該樣本為可疑樣本,應通過其它方法如測序進行進一步的分析和檢測。

來源:上海雅吉生物科技有限公司
聯(lián)系電話:021-34661275
E-mail:58268971@qq.com

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