這段時(shí)間普通民眾都是談新冠病毒色變，無非印證了一句話「人們對(duì)不了解的事物才會(huì)感到恐懼」。為了減少我們的恐懼感，讓我們來深入了解新聞發(fā)布會(huì)上不斷提及的「新冠病毒核酸檢測」吧。

首先分享中國疾控中心發(fā)布的檢測新冠病毒的引物、探針序列：

推薦選用針對(duì)新型冠狀病毒的開放讀碼框 1ab（open reading frame,ORF1ab）、核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因區(qū)域的引物和探針。

Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

這是個(gè)好消息，比較專業(yè)的同學(xué)一看就明白，根據(jù)上述疾控中心提供的資料合成引物探針后，再買個(gè)類似 Simgen 的 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Cat. No. 406100）預(yù)混 RT-PCR 試劑，就可以自制新冠病毒核酸檢測試劑盒了。不過問題來了，核酸檢測由兩塊內(nèi)容組成：核酸提取+PCR 檢測，僅有 RT-PCR 試劑是不夠的，對(duì)于病毒 RNA 檢測來說，病毒 RNA 提取反而是核酸檢測的重頭戲：因?yàn)闃颖局胁《?RNA 的數(shù)量通常很低（pg 級(jí)別）且容易降解，提取過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以至于病毒 RNA 的回收效率直接就決定了檢測的靈敏度，所以才會(huì)有一些不負(fù)責(zé)任的核酸診斷試劑廠家采用了逃避手法：只提供熒光 PCR 檢測試劑，讓用戶自己去找核酸提取方法……好吧，假如你運(yùn)氣不好，需要自己選擇病毒核酸提取方法，此文章應(yīng)該挺有價(jià)值，我們以實(shí)驗(yàn)室最常見的 Trizol 試劑來進(jìn)行病毒 RNA 的提取。

需要說明的一點(diǎn)是：我們實(shí)驗(yàn)室不是 P3 實(shí)驗(yàn)室，不敢玩非冠病毒，我們還是以同樣是 RNA 病毒的丙肝病毒血清樣本進(jìn)行測試的，請大家諒解。

一、樣本、試劑與儀器

丙肝病毒陽性血清，**** 醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，經(jīng)達(dá)安基因公司丙型肝炎病毒 (HCV) 核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）  產(chǎn)品檢測病毒濃度為 10⁵ copies/ml。

用混合的人陰性血清將 10⁵ copies/ml 丙肝病毒陽性血清病毒稀釋 10 倍獲得 10⁴ copies/ml 血清；再用混合的人陰性血清將 10⁴ copies/ml 丙肝病毒陽性血清病毒稀釋 10 倍獲得 10³ copies/ml 血清。

Simgen 病毒核酸純化試劑盒（Cat. No. 4002050），Simgen Trizol 試劑（Cat. No. 5301100），Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）
HCV 檢測試劑盒：Acon 丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒 (PCR-熒光法)
PCR 儀：ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System
離心機(jī)：Thermo Biofuge pico

二、測試方法 

1、用 Simgen 病毒核酸純化試劑盒、Trizol 加 Carrier RNA、Trizol 試劑分離純化同一管 10³ copies/ml 血清樣本中的病毒 RNA。（Trizol 提取方法：1 ml Trizol 試劑/1 ml Trizol 試劑含 3 µl Carrier RNA + 200 µl 血清混勻→+氯亻方混勻→離心取 750 µl 上清+600 µl 異丙醇→離心后用 75% 乙醇洗滌→50 µl RNase-free 水溶解，具體細(xì)節(jié)請自行腦補(bǔ)）

2、三種方法每次均從 200 µl 血清中分離純化病毒 RNA，各做兩管，RNA 最終洗脫/溶解體積為 50 µl。

三種病毒 RNA 提取方法獲得的病毒 RNA 均取 10 µl 作為模板擴(kuò)增，終反應(yīng)體積為 40 µl，使用同一批次的 Acon 丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒 (PCR-熒光法) 進(jìn)行擴(kuò)增。（注：Acon 丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒 (PCR-熒光法)RT-PCR 實(shí)際循環(huán)數(shù)為 45 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如下：42℃ 30 min,  95℃ 3 min,  [95℃ 10sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1 min(5 次循環(huán))]，[95℃ 5sec, 60℃ 32sec (40 次循環(huán))]）

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

反應(yīng)體系的陰性對(duì)照中加 10 µl 水作為模板，檢測結(jié)果為陰性。
 

用不同方法提取的 10³ copies/ml 血清樣本，檢測結(jié)果如下圖：
 

四、分析與討論 

1. 從檢測結(jié)果看，Trizol 試劑終究還是擴(kuò)增起線了，只是 CT 值很大，趴下去了。Trizol 試劑加了 Carrier RNA 后起線正常。但是比病毒核酸純化試劑盒大了差不多兩個(gè) CT 值。

2. Trizol 試劑在提取 10³ copies/ml 血清樣本的時(shí)候，起線艱難，我們很擔(dān)心提取 10² copies/ml 血清樣本的時(shí)候還能不能起線，所以我建議那些宣傳自己產(chǎn)品檢測靈敏度高達(dá) 10² copies/ml 的廠家，是不是要限制一下配套的病毒核酸提取方法，否則有虛假宣傳的嫌疑�，F(xiàn)在新聞中也經(jīng)常在爭論新冠病毒核酸檢測方法為什么有假陰性的問題，個(gè)人認(rèn)為由于病毒 RNA 樣本的特殊性，咽拭子樣本的采樣方式、保存條件，再到核酸提取，每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能會(huì)影響到后續(xù) PCR 檢測的靈敏度，所以國家藥監(jiān)局在審批新冠病毒核酸檢測試劑盒的時(shí)候應(yīng)該優(yōu)先通過包含病毒核酸抽提試劑的產(chǎn)品，這類企業(yè)提供的產(chǎn)品測試結(jié)果才會(huì)有比較高的穩(wěn)定性。

3. Trizol 試劑加了 Carrier RNA 后，起線簡直有了質(zhì)的飛越，怎么解釋？其實(shí)也簡單：pg 級(jí)的病毒 RNA 沉淀效率太低了，但是在純化體系中加了 µg 級(jí)的 Carrier RNA 后，沉淀病毒 RNA 效率完全就不是一個(gè)級(jí)別的了，我們一起看下照片：
 

大家都知道，RNA 比 DNA 要脆弱得多，很容易降解，當(dāng)然 100℃ 不失活的強(qiáng)悍 RNA 酶是罪魁禍?zhǔn)�，�?dāng) Carrier RNA 存在時(shí)，對(duì)于掩護(hù)病毒 RNA 不被 RNA 酶攻擊，也是有重大意義的。Trizol 試劑提取的病毒 RNA 擴(kuò)增曲線趴倒，不排除病毒 RNA 被降解，導(dǎo)致擴(kuò)增困難的可能性。

4. 雖然 Trizol 試劑加了 Carrier RNA 后起線好了很多，但是和病毒核酸純化試劑盒比較，還是大了兩個(gè) CT 值，也就是說病毒核酸純化試劑盒提取病毒 RNA 的效率是 Trizol 試劑+Carrier RNA 的 4 倍，怎么解釋呢？這要從 Trizol 試劑提取 RNA 的原理說起：Trizol 是硫氰酸胍+笨酚+乙酸的混合物，硫氰酸胍負(fù)責(zé)變性溶解蛋白（對(duì)于病毒顆粒最有價(jià)值的是溶解蛋白外殼）；笨酚負(fù)責(zé)萃取變性的蛋白質(zhì)；乙酸負(fù)責(zé)維持低 pH 值，確保 DNA 維持不溶解的狀態(tài)。首先在溶解病毒顆粒的環(huán)節(jié)，以胍鹽溶解蛋白（病毒顆粒）的效率低于蛋白酶 K 消化蛋白（病毒顆粒），使得病毒 RNA 的釋放效率低了一級(jí)，其次又在笨酚萃取的環(huán)節(jié)，由于刻意的調(diào)低 pH（目的是去掉 DNA，個(gè)人認(rèn)為調(diào)高 pH 有助于病毒 RNA 的回收效率，畢竟宿主的 DNA 并不干擾病毒 RNA 的擴(kuò)增），導(dǎo)致一部分病毒 RNA 又隨著相間沉淀丟失了。兩個(gè)不利因素的累積，是 Trizol 試劑提取病毒 RNA 效率低的主要原因。

其實(shí) Trizol 試劑用作病毒 RNA 的提取，并非是 zui 好的選擇，但優(yōu)點(diǎn)是幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都能拿到。Trizol 試劑用作新冠病毒 RNA 檢測時(shí)，靈敏度要達(dá)到 10² copies/ml 應(yīng)該是有困難的，如果用 Trizol 試劑檢測某些樣本的結(jié)果和本次實(shí)驗(yàn)相似（趴倒的線），建議在 Trizol 試劑中補(bǔ)加 Carrier RNA，或者購買病毒核酸純化試劑盒重測，以免漏檢或者誤判陽性樣本。