IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯的兩種不同編輯實驗流程的應用
IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)
IDT（Integrated DNA Technologies）作為核酸定制合成領域的知名企業(yè)，依托30年來的技術研發(fā)，推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因編輯產品，通過對gRNA序列、Cas9核酸酶優(yōu)化，對RNP轉染效率、同源重組修復HDR效率的提升，形成了從crRNA設計到CRISPR編輯結果檢測的一站式解決方案，讓CRISPR-Cas9系統(tǒng)更高效、更簡單。
Alt-R® CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng)，分別對crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進行優(yōu)化縮短、化學修飾，對化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內切酶結構域進行突變，獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能，再通過電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉染系統(tǒng)）轉染RNP，可進行精確地基因編輯操作。
傳統(tǒng)構建CRISPR-Cas9質粒的方法，質粒大小高達6-10kb，很難轉染，而如使用原代細胞等難轉染的細胞，轉染效率更低。且質粒不斷產生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉染RNP蛋白復合體的方法，通過優(yōu)化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎上，提高轉染效率、減少細胞毒性、降低脫靶，進而提高了基因編輯效率。
Alt-R® CRISPR-Cas9實驗流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設計工具）設計Alt-R® crRNA，使其間隔區(qū)（Spacer）序列與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合，通過crRNA的重復序列區(qū)（Repeats）與tracrRNA堿基配對, 形成向導RNA（guide RNA，簡稱gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
4、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
5、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列（前間區(qū)序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡稱PAM），對DNA進行剪切；
6、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實現(xiàn)基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設計工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復（Homology directed repair，簡稱HDR），實現(xiàn)基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
【方法二】
1、（用IDT工具）設計sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列，對DNA進行剪切；
5、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復，實現(xiàn)基因敲除；
②（用IDT工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復，實現(xiàn)基因敲入、敲除、沉默等。
Alt-R® crRNA序列設計示意圖
Alt-R® CRISPR-Cas9相關：
1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特異性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經(jīng)化學修飾防止被細胞核糖核酸酶降解，必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。
2、Alt-R® crRNA XT：相比Alt-R® crRNA，經(jīng)其他化學修飾，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗，可提高編輯的穩(wěn)定性。必須與tracrRNA一起使用。
3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個RNA，含有19-20nt的特異性序列（定制）和80nt通用序列，經(jīng)化學修飾，穩(wěn)定性更高，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗。相比體外轉錄的sgRNA，減少細胞免疫反應，更小細胞毒性。
4、Alt-R® tracrRNA：通用67nt序列，遠遠短于野生型的89nt，縮短后性能提高，經(jīng)化學修飾，具有核酸酶抗性�？商峁晒鈽擞�，檢測轉染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。
圖.穩(wěn)定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞，轉染Alt-R® crRNA(未標記):tracrRNA(標記)，轉染后48小時，熒光顯微鏡下10倍放大。
5、Alt-R® Cas9核酸酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標簽。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶，經(jīng)序列優(yōu)化，提高中靶率，降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
6、Alt-R® Cas9切口酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內切酶結構域功能失活，對DNA靶向鏈進行單鏈切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶，HNH結構域失活，對非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
7、Alt-R® dCas9蛋白：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，喪失內切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi，進行基因下調（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在轉錄起始位點附近才能發(fā)揮功能，其脫靶率遠低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
8、Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer：是Cas9特異性的載體DNA，當使用原代細胞或難轉染細胞時，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉染系統(tǒng)等電穿孔設備對RNP的轉染效率，進而提高基因編輯效率。
9、Alt-R® HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重組修復概率。在包括貼壁、懸浮的大量細胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
10、Alt-R® HDR供體寡核苷酸：專門為同源重組修復基因敲入開發(fā)，具有比標準寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率，可同時用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。
Alt-R® CRISPR-Cas9實例分析
1、特別優(yōu)化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度，提高編輯性能
以HPRT基因中的12個位點為靶點，分別使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，與Alt-R® Cas9核酸酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，轉染HEK-293細胞，培養(yǎng)48小時后，通過二代測序檢測總的編輯效率，結果顯示其具有很好的穩(wěn)定性。
2、化學修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應答和細胞毒性
以HPRT1的12個位點為靶點，分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉錄（IVT）RNA，轉染可高效表達化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細胞，24小時后，測定常見應激反應基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強烈誘導IFIT1，而Alt-R® RNA無影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對OAS2的誘導可測，而Alt-R® RNA處于基線。同時IFITM1、RIGI、OAS1等3個應激反應相關基因均得到相似結果，說明Alt-R® RNA不會激活細胞先天免疫反應。
3、優(yōu)化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特異性切割
4、電穿孔Enhancer，提高轉染效率，尤其是原代細胞等較難轉染的細胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復合體），通過Lonza Nucleofector 核轉染K562細胞（A）、Jurkat細胞（B）、HEK-293細胞（C）時，使用電穿孔Enhancer（深藍色）、不使用（淺藍色）的編輯效率。
5、HDR Enhancer，提高同源重組修復效率
①提高多種細胞HDR
以人HPRT為靶點，使用Lonza Nucleofector核轉染系統(tǒng)，將4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝），加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復DNA模板，轉染人多種細胞系。電轉后，細胞培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基中（綠色），或培養(yǎng)在含有DMSO的培養(yǎng)基中作為陰性對照（棕色），HEK-293、HeLa培養(yǎng)48小時，Jurkat、K562培養(yǎng)72小時，通過限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、靶序列PCR進行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細胞類型的同源重組修復效率。
②提高多種基因HDR
）
以人基因組多個位點為靶點，將4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過電穿孔轉染。電轉后，細胞分別培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基（藍色）、含有DMSO的培養(yǎng)基（綠色）、未處理的培養(yǎng)基（棕色），48-72小時后，通過RFLP、PCR進行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在線CRISPR序列設計工具，方便地設計高質量的crRNA/sgRNA/同源重組修復DNA模板/引物等
如物種的基因組富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點不適合，IDT同時提供CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，盡可能滿足編輯需求。
更多Alt-R® CRISPR-Cas9信息，歡迎來電咨詢13521452266
——IDT中國一級代理商，北京澤平
IDT（Integrated DNA Technologies）作為核酸定制合成領域的知名企業(yè)，依托30年來的技術研發(fā)，推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因編輯產品，通過對gRNA序列、Cas9核酸酶優(yōu)化，對RNP轉染效率、同源重組修復HDR效率的提升，形成了從crRNA設計到CRISPR編輯結果檢測的一站式解決方案，讓CRISPR-Cas9系統(tǒng)更高效、更簡單。
Alt-R® CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng)，分別對crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進行優(yōu)化縮短、化學修飾，對化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內切酶結構域進行突變，獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能，再通過電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉染系統(tǒng)）轉染RNP，可進行精確地基因編輯操作。
傳統(tǒng)構建CRISPR-Cas9質粒的方法，質粒大小高達6-10kb，很難轉染，而如使用原代細胞等難轉染的細胞，轉染效率更低。且質粒不斷產生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉染RNP蛋白復合體的方法，通過優(yōu)化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎上，提高轉染效率、減少細胞毒性、降低脫靶，進而提高了基因編輯效率。
Alt-R® CRISPR-Cas9實驗流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設計工具）設計Alt-R® crRNA，使其間隔區(qū)（Spacer）序列與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合，通過crRNA的重復序列區(qū)（Repeats）與tracrRNA堿基配對, 形成向導RNA（guide RNA，簡稱gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
4、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
5、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列（前間區(qū)序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡稱PAM），對DNA進行剪切；
6、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實現(xiàn)基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設計工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復（Homology directed repair，簡稱HDR），實現(xiàn)基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
【方法二】
1、（用IDT工具）設計sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉染等導入細胞或細胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列，對DNA進行剪切；
5、對DNA斷裂處進行修復
①進行非同源末端連接修復，實現(xiàn)基因敲除；
②（用IDT工具）設計供體DNA模板，進行同源重組修復，實現(xiàn)基因敲入、敲除、沉默等。
Alt-R® crRNA序列設計示意圖
Alt-R® CRISPR-Cas9相關：
1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特異性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經(jīng)化學修飾防止被細胞核糖核酸酶降解，必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。
2、Alt-R® crRNA XT：相比Alt-R® crRNA，經(jīng)其他化學修飾，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗，可提高編輯的穩(wěn)定性。必須與tracrRNA一起使用。
3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個RNA，含有19-20nt的特異性序列（定制）和80nt通用序列，經(jīng)化學修飾，穩(wěn)定性更高，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗。相比體外轉錄的sgRNA，減少細胞免疫反應，更小細胞毒性。
4、Alt-R® tracrRNA：通用67nt序列，遠遠短于野生型的89nt，縮短后性能提高，經(jīng)化學修飾，具有核酸酶抗性�？商峁晒鈽擞�，檢測轉染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。
圖.穩(wěn)定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞，轉染Alt-R® crRNA(未標記):tracrRNA(標記)，轉染后48小時，熒光顯微鏡下10倍放大。
5、Alt-R® Cas9核酸酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標簽。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶，經(jīng)序列優(yōu)化，提高中靶率，降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
6、Alt-R® Cas9切口酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內切酶結構域功能失活，對DNA靶向鏈進行單鏈切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶，HNH結構域失活，對非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
7、Alt-R® dCas9蛋白：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，喪失內切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His標簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi，進行基因下調（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在轉錄起始位點附近才能發(fā)揮功能，其脫靶率遠低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
8、Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer：是Cas9特異性的載體DNA，當使用原代細胞或難轉染細胞時，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉染系統(tǒng)等電穿孔設備對RNP的轉染效率，進而提高基因編輯效率。
9、Alt-R® HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重組修復概率。在包括貼壁、懸浮的大量細胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
10、Alt-R® HDR供體寡核苷酸：專門為同源重組修復基因敲入開發(fā)，具有比標準寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率，可同時用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。
Alt-R® CRISPR-Cas9實例分析
1、特別優(yōu)化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度，提高編輯性能
以HPRT基因中的12個位點為靶點，分別使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，與Alt-R® Cas9核酸酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，轉染HEK-293細胞，培養(yǎng)48小時后，通過二代測序檢測總的編輯效率，結果顯示其具有很好的穩(wěn)定性。
2、化學修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應答和細胞毒性
以HPRT1的12個位點為靶點，分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉錄（IVT）RNA，轉染可高效表達化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細胞，24小時后，測定常見應激反應基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強烈誘導IFIT1，而Alt-R® RNA無影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對OAS2的誘導可測，而Alt-R® RNA處于基線。同時IFITM1、RIGI、OAS1等3個應激反應相關基因均得到相似結果，說明Alt-R® RNA不會激活細胞先天免疫反應。
3、優(yōu)化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特異性切割
4、電穿孔Enhancer，提高轉染效率，尤其是原代細胞等較難轉染的細胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復合體），通過Lonza Nucleofector 核轉染K562細胞（A）、Jurkat細胞（B）、HEK-293細胞（C）時，使用電穿孔Enhancer（深藍色）、不使用（淺藍色）的編輯效率。
5、HDR Enhancer，提高同源重組修復效率
①提高多種細胞HDR
以人HPRT為靶點，使用Lonza Nucleofector核轉染系統(tǒng)，將4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝），加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復DNA模板，轉染人多種細胞系。電轉后，細胞培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基中（綠色），或培養(yǎng)在含有DMSO的培養(yǎng)基中作為陰性對照（棕色），HEK-293、HeLa培養(yǎng)48小時，Jurkat、K562培養(yǎng)72小時，通過限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、靶序列PCR進行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細胞類型的同源重組修復效率。
②提高多種基因HDR
）以人基因組多個位點為靶點，將4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過電穿孔轉染。電轉后，細胞分別培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基（藍色）、含有DMSO的培養(yǎng)基（綠色）、未處理的培養(yǎng)基（棕色），48-72小時后，通過RFLP、PCR進行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在線CRISPR序列設計工具，方便地設計高質量的crRNA/sgRNA/同源重組修復DNA模板/引物等
如物種的基因組富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點不適合，IDT同時提供CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，盡可能滿足編輯需求。
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