scale-X™ 生物反應(yīng)器在病毒載體生產(chǎn)中的應(yīng)用
Vero 細(xì)胞均勻生長(zhǎng)的應(yīng)用筆記
摘要
scale-X 生物反應(yīng)器是一種新型固定床系統(tǒng)，可用于貼壁和懸浮細(xì)胞系的培養(yǎng)。設(shè)備單元占地小，而具有相當(dāng)大的表面積，從而可獲得極高細(xì)胞密度。本研究比較了在scale-X hydro生物反應(yīng)器和標(biāo)準(zhǔn)微載體培養(yǎng)體系中進(jìn)行的貼壁Vero細(xì)胞培養(yǎng)。兩種系統(tǒng)可獲得相似的單位面積細(xì)胞濃度。隨后，展開螺旋卷式固定床顯示，細(xì)胞在軸向和徑向上具有均勻的分布。這表明在生物反應(yīng)器內(nèi)部具有均勻的液體流動(dòng)和細(xì)胞附著。觀察到的均質(zhì)的細(xì)胞生長(zhǎng)是一個(gè)重要的規(guī)模放大因素，以按可重復(fù)的方式，實(shí)現(xiàn)可用表面積最大限度的利用。
scale-X生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介
大多數(shù)病毒疫苗的生產(chǎn)工藝基于貼壁細(xì)胞平臺(tái)。典型的培養(yǎng)系統(tǒng)，如滾瓶、多層細(xì)胞培養(yǎng)皿和微載體生物反應(yīng)器，在規(guī)模放大時(shí)，都有一定的限制。為了克服潛在的規(guī)模放大限制，簡(jiǎn)化生產(chǎn)，固定床生物反應(yīng)器是一個(gè)極具價(jià)值的替代選擇。創(chuàng)新的scale-X生物反應(yīng)器是一種可規(guī)模放大的固定床系統(tǒng)，可從研發(fā)（2.4 m2生長(zhǎng)表面積）放大到中試（10和30m2生長(zhǎng)表面積）和生產(chǎn)規(guī)模（200和600m2生長(zhǎng)表面積；圖1）。scale-X專利技術(shù)使用了一種結(jié)構(gòu)化的螺旋卷式非編織聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）固定床，以減少局部過度壓實(shí)和死區(qū)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)可用內(nèi)表面積及質(zhì)量的最佳利用，獲得批次間的高可重復(fù)性（圖2）。
材料、方法 & 設(shè)備
固定床工藝：scale-X hydro生物反應(yīng)器
細(xì)胞系和工藝條件
用于細(xì)胞密度和分布評(píng)估的方法
» 可從固定床提取12根整合的取樣條（每根1面積2.15 cm2）在1 mL細(xì)胞裂解緩沖液中充分混合3 min。消化的細(xì)胞核用結(jié)晶紫染色并進(jìn)行計(jì)算。
» 當(dāng)達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞密度后，取出固定床，小心地鋪開，剪下確定的1 cm2面積（圖3）。條帶上的細(xì)胞用試劑A100（ChemoMetec）裂解，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)。
對(duì)照工藝：在攪拌罐生物反應(yīng)器（STR）中進(jìn)行Cytodex® 1微載體培養(yǎng)
細(xì)胞系和工藝條件
用于細(xì)胞密度和分布評(píng)估的方法
» 從生物反應(yīng)器取5 mL樣品體積。進(jìn)行三次的洗脫后，用0.1 M檸檬酸、0.1%結(jié)晶紫和0.1% Triton X-100溶液裂解細(xì)胞。
» 37℃孵育1小時(shí)后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)染色的細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法詳細(xì)描述，參見Trabelsi et al.文章（Khaled Trabelsi, 2004）。
工藝參數(shù)（用于兩種培養(yǎng)）
» 添加4 mM谷氨酰胺的無(wú)血清培養(yǎng)基（VP-SFM， Gibco™）
» 補(bǔ)加葡萄糖和谷氨酰胺原液，以分別防止兩種底物低于8 mM和2 mM
» 使用CO2和 0.5 NaHCO3（微載體）或0.5 NaOH（scale-X）將pH值控制為7.2
» 溫度設(shè)定點(diǎn)為37℃
» 溶氧設(shè)定點(diǎn)為50%（頂部空間通氣）
VERO細(xì)胞生長(zhǎng)
比較不同生物反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)的最大Vero細(xì)胞密度（Kiesslich，2020）（圖4）：
scale-X hydro 生物反應(yīng)器（2.4 m2）:2.7 x 105 cells/cm2
STR Cytodex® 1（0.75 m2）：2.4 x 105 cells/cm2
不同的細(xì)胞接種密度導(dǎo)致了不同但相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)曲線圖。scale-X生物反應(yīng)器中的單位面積細(xì)胞密度（2.7x 105 cells/m2）略高于微載體培養(yǎng)（2.4 x 105 cells/m2）。兩種系統(tǒng)的培養(yǎng)基使用量接近，為2.1 - 2.2 ×109 cells/L培養(yǎng)基。當(dāng)考慮兩個(gè)系統(tǒng)在同等產(chǎn)量下的反應(yīng)器體積時(shí)，固定床生物反應(yīng)器的設(shè)備占地顯著降低（降低5倍）。
圖4. 相比標(biāo)準(zhǔn)微載體培養(yǎng)，scale-X hydro生物反應(yīng)器中的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)，由Kiesslich et al.（2020）提供。
Univercells進(jìn)行了延長(zhǎng)的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)研究（圖5）。在scale-X hydro生物反應(yīng)器中進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)（n=26），獲得了可重復(fù)的細(xì)胞密度，平均為2.5×105 cells/cm2。規(guī)模放大至更大的scale-X carbo生物反應(yīng)器（10m2和30m2），可獲得相似的單位面積細(xì)胞密度。
圖5. Vero 細(xì)胞曲線圖：試驗(yàn)以Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)在不同scale-x 規(guī)格體積（內(nèi)部數(shù)據(jù)）
在結(jié)構(gòu)化、螺旋卷式固定床中的Vero細(xì)胞分布
在培養(yǎng)的不同階段（2.7×105 cells/cm2和5.3×105 cells/cm2時(shí)，圖6），對(duì)Vero細(xì)胞分布進(jìn)行了研究。為此，從展開的固定床中提取了9個(gè)樣本，并測(cè)定細(xì)胞密度。
在scale-X hydro生物反應(yīng)器中，Vero細(xì)胞在固定床中軸向和徑向均勻分布。研究進(jìn)行了進(jìn)一步的計(jì)算機(jī)流體動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果顯示，在結(jié)構(gòu)化固定床中沒有死區(qū)和非均勻性（數(shù)據(jù)未顯示）。均勻的細(xì)胞生長(zhǎng)使可用表面積得到充分利用。
圖6. scale-X生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)化固定床中的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)分布。
細(xì)胞沿徑向（從中心半徑）和軸向（固定床高度）均勻分布。（a.）由Kiesslich et al.（2020）友情提供，（b.）在Univercells實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
總結(jié)
在這兩種工藝中，貼壁Vero細(xì)胞達(dá)到了相同的密度。當(dāng)轉(zhuǎn)移到更大的固定床scale-X生物反應(yīng)器時(shí)，達(dá)到了類似的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)和最高單位面積細(xì)胞密度。最后，對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)分布的研究顯示，固定床內(nèi)有均勻的細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)。與微載體工藝相比，固定床的緊湊設(shè)計(jì)使設(shè)備占地面積降低5倍。
總體而言，結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)化的scale-X固定床生物反應(yīng)器系統(tǒng)是傳統(tǒng)“規(guī)模擴(kuò)展”技術(shù)的合適替代方案，后者如多層培養(yǎng)皿和滾甁，也包括具有一定技術(shù)挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)系統(tǒng)，如微載體工藝。
目前的scale- X生物反應(yīng)器可以轉(zhuǎn)化至生產(chǎn)規(guī)模（600 m2），并整合到連續(xù)的NevoLine™生產(chǎn)平臺(tái)中。NevoLine系統(tǒng)將強(qiáng)化的上游工藝與連續(xù)的下游工藝相結(jié)合，以降低資本投入和運(yùn)營(yíng)成本，實(shí)現(xiàn)低成本、大規(guī)模的生產(chǎn)能力。
參考文獻(xiàn)
Khaled Trabelsi, S. R. (2004). Comparison ofvarious culture modes for the production of rabies virus by Vero cells grown onmicrocarriers in a 2-l bioreactor. Enzyme and Microbial Technology.
Kiesslich, S.V.-C.-F. (2020). Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells:Microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology.
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