基于報(bào)告基因生物學(xué)活性探索方法
瀏覽次數(shù)：3786 發(fā)布日期：2020-10-27
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基于報(bào)告基因生物學(xué)活性探索方法 |
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| 近年來(lái)，隨著生物藥物的快速發(fā)展，報(bào)告基因法逐漸應(yīng)用于生物藥的生物學(xué)活性檢測(cè)之中。通常是在充分理解藥物分子藥理機(jī)制的基礎(chǔ)上，構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞模型，通過(guò)激活待測(cè)藥物參與的信號(hào)通路產(chǎn)生生物效應(yīng)，從而反映藥物的生物學(xué)活性。 |
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| 報(bào)告基因法是通過(guò)分子生物手段將報(bào)告基因整合入待測(cè)的生物系統(tǒng)中，繼而通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因產(chǎn)生的信號(hào)，研究特定生物學(xué)過(guò)程的方法。在實(shí)際操作中通常是將報(bào)告基因與目的基因或調(diào)控序列連接，如將報(bào)告基因置于特定啟動(dòng)子調(diào)控序列之后，研究某種條件下啟動(dòng)子的調(diào)控或特定基因調(diào)控下目的蛋白的表達(dá)。作為報(bào)告基因，其序列和功能通常已知且其表達(dá)產(chǎn)物易于被檢測(cè)。目前已鑒定并商品化的報(bào)告基因有氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶( CAT)、 β-半乳糖苷酶( β-gal)、β-葡萄糖苷酸酶( p-GUS) 、分泌型堿性磷酸酶( SEAP)、熒光素酶(LUC)、綠色熒光蛋白( GFP)等。 |
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| 藥品有效性必須是療效確切，且含有特定的有效活性成分及一定的濃度含量。在藥物研發(fā)的過(guò)程中，為了評(píng)價(jià)藥物的有效性和臨床應(yīng)用價(jià)值，生物學(xué)活性的測(cè)定是重要的手段之一�，F(xiàn)階段的生物學(xué)活性分析方法主要是在體外檢測(cè)，大多以細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行研究。近年來(lái)，隨著生物藥物的快速發(fā)展，報(bào)告基因法逐漸應(yīng)用于生物藥的生物學(xué)活性檢測(cè)之中。通常是在充分理解藥物分子藥理機(jī)制的基礎(chǔ)上，構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞模型，通過(guò)激活待測(cè)藥物參與的信號(hào)通路產(chǎn)生生物效應(yīng)，從而反映藥物的生物學(xué)活性。 |
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下面我們來(lái)看下具體的應(yīng)用實(shí)例： |
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01：抗 HER2 單克隆抗體 ADCC 生物學(xué)活性的測(cè)定 |
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| 人表皮生長(zhǎng)因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）基因編碼了一個(gè)跨膜酪氨酸激酶受體家族中的受體蛋白。 |
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| 該蛋白在正常情況下處于非激活狀態(tài)，主要在胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)，成年后僅在少數(shù)正常組織中微量表達(dá)，參與細(xì)胞的分化調(diào)控。已有研究表明，HER2 的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)，在乳腺癌，卵巢癌，胃癌等癌癥中均存在不同程度的 HER2 過(guò)表達(dá)。因此 HER2 是腫瘤免疫治療研究中的一個(gè)重要靶點(diǎn)。 |
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| 在 HER2 單抗類藥物的作用機(jī)制里，單抗可作為ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）的潛在介質(zhì)，與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合進(jìn)而激活效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷。 |
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| 在經(jīng)典的 ADCC 測(cè)定方法中，是將靶細(xì)胞暴露于結(jié)合單抗的效應(yīng)細(xì)胞中,如外周血單核細(xì)胞（PBMC）或自然殺傷細(xì)胞（NK），通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞毒性判定 ADCC 活性。但該方法依賴原始的效應(yīng)細(xì)胞，原始效應(yīng)細(xì)胞的提取繁瑣，個(gè)體差異明顯，容易造成較高的背景值。將 Jurkat 細(xì)胞做工程改造，以 NFAT 應(yīng)答元件驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)為平臺(tái)則成功的避免了傳統(tǒng)方法的弊端，并可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)單抗的生物學(xué)活性。 |
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| 構(gòu)建 Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT 細(xì)胞株并進(jìn)行篩選鑒定，以 SKBR3（乳腺癌細(xì)胞系）作為靶細(xì)胞。向 SKBR3 細(xì)胞板內(nèi)接種 Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT 細(xì)胞，并加入不同濃度梯度的單抗溶液。將細(xì)胞板置于 37℃、5% CO2條件下誘導(dǎo) 20h 后加入熒光素酶底物溶液，避光反應(yīng) 5min 后使用酶標(biāo)儀讀取熒光信號(hào)，所得的數(shù)據(jù)使用四參數(shù)擬合方式，R2>0.99，如圖 1，EC50 為 13.27 ng·mL-1。 |
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圖 1 建立抗 HER2 單抗的 ADCC 劑量效應(yīng)曲線 |
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圖 2 利用報(bào)告基因法比較 3 株不同的 HER2+ 靶細(xì)胞 |
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如圖 2，以不同的 HER2+ 的人乳腺癌細(xì)胞系 SKBR3、BT474 及 MCF7 作為靶細(xì)胞進(jìn)行 ADCC 活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) SKBR3 細(xì)胞呈現(xiàn)更好的劑量效應(yīng)。 |
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02：免疫檢查點(diǎn)抑制劑——PD1/PD-L1 抗體的生物活性學(xué)檢測(cè) |
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| 研究表明 PD-1 主要限制慢性炎癥、感染或癌癥中的 T 細(xì)胞活性，PD-1 有兩個(gè)配體，PD-L1和PD-L2。在腫瘤的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá) PD-L1或者 PD-L2。癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)摧毀的一種方法，是通過(guò)配體聯(lián)接到T細(xì)胞的 PD-1 蛋白上。當(dāng)配體與 PD-1 聯(lián)接以后，T細(xì)胞就不能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤和向免疫系統(tǒng)發(fā)出攻擊腫瘤的信號(hào)。針對(duì) PD-1 分子的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)治療癌癥的研究曾于 2018 年榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，目前抗 PD-1 單抗及抗 PD-L1 單抗越來(lái)越成為各國(guó)抗體研發(fā)中炙手可熱的治療性單克隆抗體，作為免疫檢測(cè)點(diǎn)靶向抗體，可以用于治療黑色素瘤、晚期腎 細(xì)胞癌、晚期（轉(zhuǎn)移性）非小細(xì)胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、皮膚癌等腫瘤。 |
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| PD1 藥物的設(shè)計(jì)思路是：給予腫瘤患者針對(duì) PD-1 或 PD-L1 的一種抗體蛋白質(zhì)，將使兩種蛋白質(zhì)不會(huì)聯(lián)接，T細(xì)胞的功能也不會(huì)關(guān)停，且 PD-1 通路的抑制會(huì)加速和加強(qiáng)自身免疫。 |
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| 為了驗(yàn)證抗體藥物的生物學(xué)活性，研究人員構(gòu)建了分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因效應(yīng)細(xì)胞系和靶細(xì)胞系（如下所示） |
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| 效應(yīng)細(xì)胞系： |
| Jurkat-hFcγＲⅢa-NFAT |
| ( 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 FcγＲIIIa 及 NFAT 反應(yīng)元件） |
| 靶細(xì)胞系： |
| 293FT-PD-1 ( 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 PD-1 分子） |
| CHO-PD-L1 ( 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 PD-L1 分子） |
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| 將 Jurkat-hFcγＲⅢa-NFAT 效應(yīng)細(xì)胞系分別加入到293FT-PD-1和 CHO-PD-L1 細(xì)胞中，并對(duì)應(yīng)加入不同濃度的抗 PD-1 單抗和抗 PD-L1 單抗溶液。誘導(dǎo)20h后加入熒光素酶底物，在 Molecular Devices 酶標(biāo)儀上讀取相對(duì)光單位( relative light unit，RLU） 數(shù)值并按以下公式計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)( fold of induction， FI) 。FI = RLU( 反應(yīng)均值－背景均值) /RLU( 陰性對(duì)照均值－背景均值） ; 利用 SoftMax 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以單抗?jié)舛葘?duì)數(shù)為 x 軸，對(duì)應(yīng)的 FI 值為 y 軸，選用四參數(shù)方程回歸模型，擬合單抗的劑量效應(yīng)曲線。 |
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圖3 抗PD-1/PD-L1 單抗的 ADCC 劑量效應(yīng)曲線 |
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研究人員用該檢測(cè)方法分別確定了效靶比，誘導(dǎo)時(shí)間等（圖4和圖5）。 |
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圖4 抗 PD-1/PD-L1 單抗不同效靶比對(duì)比結(jié)果 |
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圖5 抗 PD-1/PD-L1 單抗不同效靶比及誘導(dǎo)時(shí)間的信噪比結(jié)果 |
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由于很多生物藥沒(méi)有強(qiáng)反應(yīng)性的細(xì)胞系或者沒(méi)有易檢測(cè)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，基于報(bào)告基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系指示藥物活性成為很好的選擇。中國(guó)食品藥品檢定研究院有豐富的報(bào)告基因測(cè)定大分子藥物生物學(xué)活性的技術(shù)儲(chǔ)備，已經(jīng)率先建立了多品種的報(bào)告基因測(cè)活方法，包括干擾素、促胰島素分泌肽融合蛋白、促紅細(xì)胞生成素以及抗 VEGF 靶點(diǎn)抗體的熒光素酶報(bào)告基因方法。這一系列的研究結(jié)果突破了傳統(tǒng)生物活性檢測(cè)的限制，為保證用藥的安全性，時(shí)效性，提高檢驗(yàn)質(zhì)量提供了保障。 |
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