1873年，德國醫(yī)師Ernst Abbe 提出了“衍射極限”的概念。他預(yù)測，由于光的基本衍射性質(zhì)，光學(xué)顯微鏡無法實(shí)現(xiàn)200nm以下的分辨率。實(shí)際上，當(dāng)兩個(gè)相隔很近的物點(diǎn)同時(shí)發(fā)光時(shí)，得到的圖像是模糊的，無法分辨。超分辨率顯微鏡（SRM）的誕生打破了一個(gè)世紀(jì)多以來一直被認(rèn)為無法突破的瓶頸。

 

如今，科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)了多種超分辨率技術(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了衍射極限，能夠觀察到分子尺度的細(xì)節(jié)。SRM技術(shù)可以將細(xì)胞結(jié)構(gòu)解析為亞細(xì)胞水平，從而獲取有關(guān)細(xì)胞組分的3D結(jié)構(gòu)的信息，并可以觀察到單分子共定位。

 

下面我們來簡要概述了時(shí)下幾種最流行的SRM技術(shù)的原理：

 

 

1.受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡

 

STED對于有經(jīng)驗(yàn)的熒光顯微鏡使用者來說相對簡單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個(gè)光源發(fā)射能激發(fā)熒光團(tuán)——熒光標(biāo)簽（研究者們以此來定位和觀察蛋白）的光，另一個(gè)光源發(fā)出不同波長的光，用于抑制熒光。這束光是環(huán)形的，并且與第一束光有所重疊，因此只有環(huán)形中間區(qū)域的分子會(huì)繼續(xù)發(fā)出熒光。

 

獲得STED超分辨率圖片并沒有那么復(fù)雜，用戶需要仔細(xì)調(diào)整參數(shù)，才能得到漂亮的結(jié)果，否則所得圖片和普通confocal沒有差別。

 

使用傳統(tǒng)和RESCue受激發(fā)射減損顯微鏡（STED）得到的細(xì)胞核膜上核孔復(fù)合體的圖片。

 

STED的原理：

 

顯微鏡透鏡對光的衍射會(huì)導(dǎo)致來自單個(gè)點(diǎn)的光出現(xiàn)在較大的區(qū)域，這稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）（見圖1），由于PSF的存在，使得常規(guī)顯微鏡無法達(dá)到超分辨。

 

 

圖1：在普通光學(xué)顯微鏡中，成像是通過將來自點(diǎn)光源的光線會(huì)聚到像平面上的單個(gè)點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的。超出光衍射的限制，防止了射線的精確會(huì)聚，從而導(dǎo)致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的大小，或?qū)ο笤谀硞�(gè)點(diǎn)的三維強(qiáng)度分布。在STED中，應(yīng)用環(huán)形炸彈耗盡型激光器，其零點(diǎn)與激發(fā)激光焦點(diǎn)的最大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑制了來自零點(diǎn)附近區(qū)域的熒光，導(dǎo)致有效PSF的尺寸減小”。

 

而受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡通過限制樣品的熒光區(qū)域（PSF）產(chǎn)生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個(gè)重疊的激光，第一個(gè)按照常規(guī)顯微鏡激發(fā)熒光團(tuán)（圖2A）。第二個(gè)激光器稱為耗盡激光器（STED激光器），它激發(fā)“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強(qiáng)度點(diǎn)非常�。�〜30 nm）（未激發(fā)）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關(guān)閉”第一激光所產(chǎn)生的外圈熒光，從而將樣本激發(fā)的熒光分子范圍縮小到中心圓點(diǎn)處，這有效地降低了PSF，以產(chǎn)生非常小的單分子熒光聚焦區(qū)域，從而獲得高分辨率圖像（圖2D）。

 

圖2：

 

單個(gè)小于250 nm的蛋白質(zhì)無法通過標(biāo)準(zhǔn)共聚焦成像解析，從而導(dǎo)致圖像模糊

STED耗盡激光器產(chǎn)生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

飽和耗盡在功能上降低了激勵(lì)PSF

隨之可以解析單個(gè)蛋白質(zhì)

 

適用于STED的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體：

 

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長的高發(fā)射截面，并有效地實(shí)現(xiàn)高飽和度。這種強(qiáng)烈的照明確保了所有被STED激光“關(guān)閉”的分子都受受激發(fā)射的支配。合適的染料應(yīng)具有低的光漂白性，具有高的量子產(chǎn)率和對比度，并在目標(biāo)附近具有足夠的標(biāo)記密度。

 

Jackson提供熒光染料標(biāo)記的二抗，下列染料標(biāo)記的二抗已被驗(yàn)證在STED中成功使用： AlexaFluor®488（如：115-545-003），F(xiàn)ITC（如：715-095-150），AlexaFluor®594（如：715-585-151）和AlexaFluor®647。

 

2. 隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）

 

最有名的“基于探針”的技術(shù)是Betzig等人研發(fā)的光激活定位顯微技術(shù)（photoactivated localization microscopy, PALM）和哈佛大學(xué)莊小威實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的熒光標(biāo)簽都是暗的。然后使用激光脈沖來激活一小部分熒光標(biāo)簽，隨后使用另一束光來關(guān)閉這些熒光標(biāo)簽。不斷重復(fù)這個(gè)過程，生成一系列部分熒光圖，最后重建成整個(gè)視野的熒光圖。，以產(chǎn)生分辨率優(yōu)于常規(guī)方法收集的圖像。

 

使用超分辨率隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科學(xué)家首次觀察到了神經(jīng)元軸突的細(xì)胞骨架。

 

Jackson提供適用于dSTORM應(yīng)用的標(biāo)記二抗，簡而言之，較低強(qiáng)度的激發(fā)光激發(fā)樣品，隨機(jī)激活少量染料分子。單個(gè)發(fā)熒光的染料分子足夠分散，因此可以計(jì)算其點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心，從而推斷出染料的確切位置。然后使用第二激光關(guān)閉所有分子，并重復(fù)該過程。然后，通過重疊每種染料的所有映射點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，以數(shù)學(xué)方式生成高分辨率圖像。

 

用于單分子定位實(shí)驗(yàn)的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體
 

用于單分子定位的最佳染料通常非常亮，并產(chǎn)生足夠的光子以可靠地產(chǎn)生緊密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多種廣譜范圍內(nèi)的可靠染料，例如AlexaFluor®488，AlexaFluor®647和Cy™5，可用于這些類型的實(shí)驗(yàn)。

 

建議用于超分辨率顯微鏡的熒光染料偶聯(lián)物：

 

STED	激發(fā)波長（nm）	發(fā)射波長（nm）
Alexa Fluor® 488	493	519
熒光素 / FITC	492	520
Alexa Fluor® 594	591	614
Alexa Fluor® 647	651	667

 

STORM	激發(fā)波長（nm）	發(fā)射波長（nm）
Alexa Fluor® 488	493	519
Alexa Fluor® 647	651	667
Cy™5	650	670

 

每種SRM技術(shù)都有各自的探針選擇要求，Jackson ImmunoResearch提供多種已知在SRM應(yīng)用中表現(xiàn)良好的熒光標(biāo)記二抗。應(yīng)該注意的是，SRM領(lǐng)域變化迅速，因此，建議從專業(yè)技術(shù)文獻(xiàn)中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團(tuán)。

 

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