在《 Hello~自噬 》一文中，我們?cè)�給大家介紹過(guò)自噬。自噬在維持穩(wěn)態(tài)和多種疾病中都起著重要作用。那么在實(shí)驗(yàn)中，如何檢測(cè)自噬呢？



自噬，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是細(xì)胞自己吃自己、廢物再利用。細(xì)胞陷于困境時(shí) (如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏)，啟動(dòng)自噬程序自救，通過(guò)降解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器獲得必需的氨基酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持基本生命活動(dòng)，以便死中求生。一直以來(lái)， 自噬都是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2020 年 8 月 17 日，圖盧茲大學(xué)綜合生物研究中心 Arnaud Besson 教授團(tuán)隊(duì)，在期刊 Nature cell biology 中發(fā)表的自噬相關(guān)文章 (圖 1) ，闡明了自噬與細(xì)胞周期調(diào)控的新機(jī)制。

圖 1. p27 調(diào)控自噬-溶酶體途徑，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期和生長(zhǎng)




背景介紹



p27 ^Kip1 (p27) 被認(rèn)為是細(xì)胞周期蛋白 CDK 的抑制因子，具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的能力。營(yíng)養(yǎng)匱乏往往是自噬發(fā)生的主要誘導(dǎo)原因，已有研究表明，細(xì)胞質(zhì)中的 p27 是自噬的正調(diào)節(jié)劑 (葡萄糖匱乏或者血清剝奪的條件下) ，它可以保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是，p27 調(diào)控自噬作用的具體分子機(jī)制仍然是未知的。





p27 調(diào)控細(xì)胞自噬
 

作者團(tuán)隊(duì)通過(guò)研究 p27^+/+ MEFs 和 p27^-/- MEFs 應(yīng)對(duì)氨基酸剝奪后自噬的變化，證明了氨基酸缺乏的細(xì)胞中，p27 促進(jìn)自噬。

 

細(xì)胞：

 

p27^+/+ MEFs: p27 野生型 (p27^+/+) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEFs)，源于 p27 野生型小鼠胚胎。

p27 ^+/+ MEFs: p27 缺失型 (p27 ^-/- ) MEFs，源于 p27 缺失的小鼠胚胎。

1、p27 促進(jìn)自噬發(fā)生
LC3B-II 是自噬小體的標(biāo)記物，位于自噬體膜，與溶酶體融合時(shí)被降解。氨基酸剝奪的短時(shí)間內(nèi)，如圖 2a 所示，p27 ^+/+ 和 p27 ^-/- 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，LC3B-II 表達(dá)水平相似，隨著氨基酸剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，p27 ^-/-  中的 LC3B-II 表達(dá)水平明顯會(huì)更高，并且在 48 小時(shí)表現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (圖 2b) 。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，選擇 48 小時(shí)作為氨基酸的長(zhǎng)時(shí)間剝奪的誘導(dǎo)時(shí)間。圖 2c 的 LC3B 的免疫熒光染色同樣也呼應(yīng)這一觀察結(jié)果 (紅色箭頭) 。這表明 p27 可促進(jìn)氨基酸剝奪細(xì)胞中的自噬。

圖 2. 氨基酸剝奪不同時(shí)間，細(xì)胞中  LC3B，LC3B-I 和 LC3B-II 的表達(dá)
【a-b: 指定時(shí)間段內(nèi)氨基酸缺失的 p27 ^+/+ 和 p27 ^-/- MEFs 的 LC3B-I 和 LC3B-II 的表達(dá)和定量分析；c-d: p27 ^+/+  和 p27 ^-/-  MEFs 在 0 h 和氨基酸剝奪 48 h 后 LC3B（綠色熒光）免疫熒光染色和定量分析】

 

2、p27 調(diào)控自噬流的檢測(cè)

 

自噬是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過(guò)程，當(dāng)應(yīng)答營(yíng)養(yǎng)匱乏的壓力時(shí) (如氨基酸或葡萄糖缺乏)，細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)，隨后會(huì)在胞漿處形成一種扁平的叫做吞噬泡 (Phagophore) 的雙層膜結(jié)構(gòu)。緊接著，吞噬泡不斷延伸，包裹一些細(xì)胞元件或者自噬物 (Autophagic cargo)，形成密閉的球狀的自噬小體 (Autophagosome)。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體 (Autolysosome)，自噬體中的內(nèi)容物被溶酶體中的酶降解，降解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被細(xì)胞重新利用。

 

在整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞將自噬物吞噬到自噬小體，直到最后自噬溶酶體形成并降解自噬物的這個(gè)過(guò)程被稱為自噬流 (Autophagic flux) (圖 3)。自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬都無(wú)法完成其生物學(xué)功能。

 

圖 3. 細(xì)胞應(yīng)答營(yíng)養(yǎng)匱乏壓力時(shí)，自噬發(fā)生的示意圖^[2]
【吞噬泡 (Phagophore)-自噬小體 (Autophagosome)-自噬溶酶體 (Autolysosome)】

 

上文已經(jīng)說(shuō)到 LC3B-II 通常是自噬小體的 Marker，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) LC3B 的總量通常不會(huì)有巨大波動(dòng)，一般只會(huì)出現(xiàn) LC3B-I 和 LC3B-II 間的相互轉(zhuǎn)換。

 

如果 LC3B-II 表達(dá)增加，可能是由于前期自噬活化后自噬小體增多導(dǎo)致的，也可能是后期自噬溶酶體清除失敗使其積累所致。因此，某單一時(shí)間點(diǎn)的 LC3B-II 的表達(dá)改變并不能體現(xiàn)自噬流的改變。

 

在文章中，使用了 WB 檢測(cè)蛋白、免疫熒光，mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光系統(tǒng)的組合測(cè)量方法，檢測(cè) p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 自噬流。

 

(1) 氯喹   ( Chloroquine ，CQ) 處理，檢測(cè)自噬流中 LC3B-II 變化

在酸性溶酶體中，氯喹會(huì)使溶酶體 pH 值升高，使溶酶體中酸性水解酶失活 ，從而抑制細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的融合與降解。氯喹處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致 LC3B-II 的聚集，此時(shí)觀察到的 LC3B-II 的變化僅代表自噬小體數(shù)量的改變。


氯喹處理細(xì)胞后，在短期氨基酸剝奪的條件下 (0-4 h) ，兩種細(xì)胞的自噬通量是相似的 (圖 4a, b) 。但是隨著時(shí)間的增加，長(zhǎng)時(shí)間的氨基酸剝奪處理后，p27 ^-/- MEFs 與 p27 ^+/+ MEFs 相比，LC3B-II 數(shù)量顯著降低 (圖 4c, d) 。這說(shuō)明 p27 促進(jìn)氨基酸缺失細(xì)胞中自噬通量。

圖 4. 氯喹影響細(xì)胞 LC3B-II 的表達(dá)

【a-b: p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 中，aa-剝奪 0 h、1 h、4 h 后 (有或無(wú)氯喹處理) , LC3B-II 的表達(dá)和不同細(xì)胞中自噬流變化的定量分析 (LC3B-II+CQ/actin)/(LC3B-II-CQ/actin)；c-d: aa-剝奪 0 h、48 h 后，LC3B-II 的表達(dá)和自噬流變化的定量分析】

 

(2) p62/SQSTM1 在細(xì)胞中的積累

 

p62 也稱為 SQSTM1 蛋白，作為一種調(diào)節(jié)因子參與自噬體的構(gòu)成，具有底物的特異性，是連接 LC3B-II 與待降解泛素化底物的橋梁。p62 結(jié)合泛素化蛋白進(jìn)入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除 (圖 5a)。自噬流被抑制時(shí)，p62/SQSTM1 會(huì)在自噬流受損的細(xì)胞中積累, 在細(xì)胞內(nèi)整體 p62 水平的表達(dá)與自噬活性存在負(fù)相關(guān)。

 

如圖 5 b 所示，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，p62 在氨基酸缺乏的 p27^-/- 細(xì)胞中的表達(dá)量更高，p27^-/- 細(xì)胞的自噬流受損，這進(jìn)一步說(shuō)明了，p27 可以促進(jìn)自噬流活化。

 

圖 5. p62 在自噬流受損的細(xì)胞中積累
【a: p62 參與自噬體的構(gòu)成[3]；b: aa-剝奪 0 h 或 48 h，p62 和 Vinculin (Loading control) WB 結(jié)果；c: p62 歸一化的定量分析�！�

 

(3) mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光系統(tǒng)檢測(cè)自噬體與自噬溶酶體。
mCherry (紅光) -eGFP (綠光) -LC3B 串聯(lián)熒光蛋白可用于檢測(cè)自噬流水平的融合蛋白。它利用了酸性自溶酶體和中性自噬體之間的 pH 差異以及不同熒光素對(duì) pH 的敏感性差異，以監(jiān)控從自噬體到自溶酶體的進(jìn)程 (圖 6a) 。

圖 6. 串聯(lián)熒光探針及熒光共定位檢測(cè)自噬流

【a: mCherry-eGFP-LC3B 串聯(lián)熒光探針示意圖與機(jī)制^[6]；b: p27^+/+ 和p27^-/- MEFs 中，0 h 或 aa-剝奪 48 h 時(shí)，mCherry-eGFP-LC3B 示蹤自噬體以及與自噬溶酶體形成；c: 自噬小體 (黃色) 和自噬溶酶體 (紅色) 的定量分析】

 

如圖 6a-b，mCherry 熒光基團(tuán)的 pH 值穩(wěn)定性比 GFP 高，GFP 熒光信號(hào)在進(jìn)入溶酶體后由于 pH 值的下降會(huì)出現(xiàn)淬滅，而 mCherry 熒光基團(tuán)進(jìn)入溶酶體后仍能發(fā)出熒光。因此若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠和紅色熒光共定位，即出現(xiàn)黃色熒光時(shí)，表明：mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白并未與溶酶體發(fā)生融合, 說(shuō)明了自噬流被阻斷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)僅出現(xiàn)紅色熒光而無(wú)綠色熒光時(shí)，代表 mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白定位于溶酶體或自噬溶酶體內(nèi)，即自噬流活化。

 

與 p27 ^+/+ 細(xì)胞相比，p27 ^-/- 細(xì)胞中自噬溶酶體的比例下降 (72% vs 95%) ，進(jìn)一步表明 p27 促進(jìn)自噬流 (圖 6b-c) 。

(4) p27 促進(jìn)自噬體成熟

 

圖 7. p27 促進(jìn)自噬體成熟過(guò)程的中間體形成
【a: p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 中，0 h 或 aa-剝奪 48 h 時(shí), LC3B 和 p62 的免疫染色 (虛線描繪了 LC3B 陽(yáng)性環(huán)狀結(jié)構(gòu))；b: p27^+/+ 和p27^-/- MEFs 中 LC3B 環(huán)狀聚集物的定量�！� 

 

之前有文獻(xiàn)表明 (參考文獻(xiàn) 5)，自噬體在成熟過(guò)程中，LC3B 陽(yáng)性自噬囊泡會(huì)聚集在細(xì)胞核周圍形成環(huán)狀聚集結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是自噬體成熟過(guò)程中的中間結(jié)構(gòu)。如圖 7a 所示，p27^+/+ 細(xì)胞中有明顯的環(huán)狀聚集體，但是在 p27^-/- 細(xì)胞中很少觀察到，取而代之的是小囊泡結(jié)構(gòu)。這表明 p27 可促進(jìn)自噬體成熟過(guò)程。

 

總結(jié)
 

1、在長(zhǎng)期氨基酸剝奪的情況下，與 p27^-/-  細(xì)胞相比，p27^+/+ 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中 LC3B-II 的上調(diào)，p62 蛋白表達(dá)量減少，自噬溶酶體數(shù)目比例增加，以及自噬體成熟過(guò)程環(huán)狀聚集體的形成，可以證明 p27 在氨基酸長(zhǎng)期匱乏的細(xì)胞中促進(jìn)自噬流活化。

 

2、自噬流在細(xì)胞內(nèi)是流動(dòng)的細(xì)胞代謝過(guò)程, 自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬將無(wú)法完成其生物學(xué)功能。尚無(wú)某種單一方法可以絕對(duì)準(zhǔn)確特異的檢測(cè)自噬，因此應(yīng)該使用組合的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)評(píng)估自噬活動(dòng) (自噬相關(guān)工具藥物的使用，WB 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白變化，免疫熒光共定位，以及 mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光檢測(cè)等)。

 

3、足夠的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，樂觀的心態(tài)也是實(shí)驗(yàn)成功的必要因素，M 君祝大家開學(xué)伊始，實(shí)驗(yàn)旗開得勝。

原文鏈接：DOI: 10.1038/s41556-020-0554-4.

 

 

相關(guān)化合物
Chloroquine Chloroquine phosphate	Autophagy 和 Toll-like receptors (TLRs) 的抑制劑。
Bafilomycin A1	抑制自噬 (Autophagy) 且誘導(dǎo)凋亡 (Apoptosis)。
Hoechst 33342	發(fā)藍(lán)色熒光的 DNA 染料，可以透過(guò)細(xì)胞膜。
E64d	溶酶體蛋白酶抑制劑，可用于自噬流檢測(cè)。
Leupeptin	溶酶體蛋白酶抑制劑，可用于自噬流檢測(cè)。
Pepstatin A	溶酶體蛋白酶抑制劑，可用于自噬流檢測(cè)。
自噬激活劑	包含 Rapamycin，MG-132 等 600+ 種有效的自噬激活劑。
自噬抑制劑	包含 3-Methyladenine (3-MA) ，Resatorvid (TAK-242) 等近 200 種有效的自噬抑制劑。
自噬化合物庫(kù)	收錄了 900+ 種自噬信號(hào)通路相關(guān)的產(chǎn)品，是研究自噬相關(guān)調(diào)控及疾病的有用工具。

參考文獻(xiàn) 

↓ 下滑查看更多文獻(xiàn) 

1. Ada Nowosad, et al. p27 controls Ragulator and mTOR activity in amino acid-deprived cells to regulate the autophagy-lysosomal pathway and coordinate cell cycle and cell growth. Nat Cell Biol. 2020 Aug 17.
2. Prashanta Kumar Panda, et al. Chemical Screening Approaches Enabling Drug Discovery of Autophagy Modulators for Biomedical Applications in Human Diseases. Front Cell Dev Biol. 2019 Mar 19; 7: 38.
3. Maria Condello, et al. Targeting Autophagy to Overcome Human Diseases. Int J Mol Sci. 2019 Feb 8; 20 (3): 725.
4. Liang, J. et al. Te energy sensing LKB1-AMPK pathway regulates p27kip1 phosphorylation mediating the decision to enter autophagy or apoptosis. Nat. Cell Biol. 9, 218-224 (2007)