研究背景

1、心力衰竭影響全球 2600 多萬人，心力衰竭的主要潛在原因是成年人心肌在受傷后無法自行修復(fù)。

2、哺乳動物的心臟在受傷后早期能夠通過心肌細(xì)胞增殖實現(xiàn)再生。

 

■ 重要“人物” 介紹

 

Meis1：由 Meis1 基因表達(dá)。Meis1 是 TALE 家族中一種非 Hox 同源異型盒基因。Meis1 是細(xì)胞周期阻滯的關(guān)鍵調(diào)控因子，在胚胎心肌細(xì)胞發(fā)育中起重要作用。

 

Hoxb13：同源域轉(zhuǎn)錄因子，是前列腺上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。

 

Calcineurin：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，細(xì)胞質(zhì)中一種 Ca²⁺/CaM (鈣調(diào)蛋白) 依賴性蛋白磷酸酶。當(dāng) Calcineurin 被鈣激活時，通過其下游轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子 NFAT (活化 T 細(xì)胞核因子) 介導(dǎo)肥厚反應(yīng)，NFAT 直接被 Calcineurin 去磷酸化并發(fā)生核轉(zhuǎn)位。

 

圖 1. Calcineurin 在糖尿病動脈粥樣硬化和心力衰竭中的作用通路 ^[7]

早在 2013 年，Hesham A. Sadek 研究團(tuán)隊在 Nature 發(fā)表的文章中，就將 Meis1 鑒定為心肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并認(rèn)為它是心臟再生的潛在治療靶標(biāo)。

摘要

1、Hoxb13 是再生心肌細(xì)胞中再生關(guān)鍵因子 Meis1 的輔助因子。

 

2、成年小鼠心臟 Meis1 和 Hoxb13 雙敲后促進(jìn)心肌細(xì)胞有絲分裂，使肌節(jié)處于松散狀態(tài)，改善心肌梗死后左心室收縮功能。

 

3、Meis1 和 Hoxb13 協(xié)同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞成熟和細(xì)胞周期。

 

4、Calcineurin 使 Hoxb13 在 Serine 204 位點(diǎn) (Hoxb13^S204) 處去磷酸化，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞周期阻滯。

 

研究方法

■ 動物模型

 

條件性心肌細(xì)胞特異性 Hoxb13 基因敲除的 Hoxb13-KO 小鼠 (Myh6^cre : Hoxb13^fl/fl)；

Tamoxifen 誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性 Hoxb13 蛋白缺失的 Hoxb13-iKO 小鼠 (Myh6^mERcremER Hoxb13^fl/fl)；

心肌特異性 Myh6^cre : Meis1-Hoxb13 雙敲除的 DKO 小鼠；

條件性誘導(dǎo) Meis1 和 Hoxb13蛋白 缺失的 DiKO 小鼠。

 

■ 主要實驗方法

 

免疫熒光染色；免疫印跡 (WB) ；免疫共沉淀 (Co-IP) ； 染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合下 一代測 序 (ChIP-seq) ；磁共振成像；經(jīng)胸超聲心動圖檢測；TUNEL 分析。

 

實驗結(jié)果

■ Hoxb13 與 Meis1 的關(guān)聯(lián)

 

此前的研究中，Sadek 的研究團(tuán)隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn) Hox 蛋白家族與 Meis1 有緊密聯(lián)系。在這次的研究中，通過在心臟損傷后進(jìn)行再修復(fù)的 7 天內(nèi) (P1-P7) 檢測 Hoxb13 蛋白家族的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Hoxb13 是再生后心肌細(xì)胞中與 Meis1 相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。

 

圖 2. 再生后早期 Hoxb13 的表達(dá)與 Meis1 相關(guān)
【Postnatal day：再生后天數(shù)；
P1：Hyperplastic growth，增生性生長; 
P7：Hypertrophic growth，肥厚性生長】

■ Hoxb13 的遺傳缺失

首先，研究團(tuán)隊通過 Hoxb13-KO 小鼠發(fā)現(xiàn)，短時間內(nèi) Hoxb13 的缺失誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖。另外，在注射 Tamoxifen 后，成年 Hoxb13-iKO 小鼠心臟 Hoxb13 蛋白減少，心肌細(xì)胞橫截面積 (CSA) 顯著減小，單核心肌細(xì)胞的比例也顯著增加，而雙核和多核心肌細(xì)胞的比例顯著下降。兩種小鼠實驗結(jié)果表明，心肌細(xì)胞特異性 Hoxb13 缺失足以誘導(dǎo)成年小鼠心肌有絲分裂。

圖 3. Hoxb13 缺失誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞有絲分裂和左心室射血分?jǐn)?shù) (LVEF) 的下降

除此之外，成年 Hoxb13-KO 小鼠中誘導(dǎo)了心肌梗死 (MI)，發(fā)現(xiàn) Hoxb13 的敲除可以防止 LVEF 的下降，但是左心室收縮功能并沒有改善�？偟膩碚f，Hoxb13 的缺失可預(yù)防 MI 后收縮功能的逐步惡化，但不會引起實質(zhì)性功能恢復(fù)。

 

 

■ Meis1 和 Hoxb13 蛋白共同缺失

 

Meis1-Hoxb13 的缺失，即 DKO 小鼠心臟中發(fā)現(xiàn)了心臟再生的一些特征，如心肌細(xì)胞肌小節(jié)分解，單核心肌細(xì)胞增加。并且觀察到成年小鼠中心肌細(xì)胞的增殖也很活躍。他們再進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，以評估 Meis1 和 Hoxb13 缺失對心肌肥大的影響，發(fā)現(xiàn) DKO 心臟表現(xiàn)出運(yùn)動誘發(fā)的生理性肥厚反應(yīng)減弱。

 

圖 4. DKO 小鼠心臟表現(xiàn)出
減弱運(yùn)動誘發(fā)的生理性肥大反應(yīng)

 

■ DiKO 小鼠中的心臟再生

 

那么成年小鼠心臟中條件性誘導(dǎo)的 Meis1 和 Hoxb13 缺失是否能促進(jìn)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期呢？首先，觀察發(fā)現(xiàn) DiKO 小鼠的心臟體重比變大，注射 Tamoxifen 后，心肌細(xì)胞橫截面積減少了約 30％，并且觀察心肌細(xì)胞的數(shù)量與有絲分裂發(fā)現(xiàn)，Meis1-Hoxb13 特異性缺失會誘導(dǎo)成年小鼠心室心肌細(xì)胞增殖。

 

為了檢測心肌細(xì)胞增殖水平增加是否有助于成年心臟的修復(fù)，對 DiKO 小鼠進(jìn)行 MI 干預(yù)，結(jié)果表明，Meis1 和 Hoxb13 的缺失誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖，可以改善 MI 后的左心室收縮功能。

 

圖 5. DiKO 小鼠的左心室收縮功能改善

 

另外，Meis1 和 Hoxb13 的體內(nèi)靶標(biāo)鑒定發(fā)現(xiàn)了三組不同的基因：分別是同時靶標(biāo) Meis1 和 Hoxb13 的 272 個基因，1,647 個僅靶標(biāo) Meis1 的基因和 1,326 個僅靶標(biāo) Hoxb13 的基因。通路分析證明，Meis1  和 Hoxb13 協(xié)同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的分化和細(xì)胞周期。

 

■ Calcineurin 調(diào)節(jié) Hoxb13

蛋白免疫印跡 (WB) / 免疫共沉淀 (Co-IP)  結(jié)果顯示  (蛋白提取過程中別忘了使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑來保護(hù)它們喲，戳一戳，MCE 官網(wǎng)直接可申請 蛋白酶抑制劑 、 磷酸酶抑制劑  Cocktail  試用裝哦！) ，與 Meis1 和 Hoxb13 相似，P7 時鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的催化亞基 CnA 的蛋白水平升高，并且這三種蛋白相互作用。掃描 Calcineurin 對接基序結(jié)果表明，Calcineurin 與 Hoxb13 直接相互作用，并可能將它去磷酸化。進(jìn)一步地，他們找到了作用位點(diǎn) S204，Calcineurin 依賴性的 Hoxb13^S204 去磷酸化作用促進(jìn)了Hoxb13 的核轉(zhuǎn)運(yùn)，并促進(jìn)了細(xì)胞周期的阻滯。
 

圖 6. CnA 在 P7 天的表達(dá)量升高

 

■ Calcineurin 調(diào)控心肌細(xì)胞增殖

先前有報道表明，心肌細(xì)胞中 CnA 的過度表達(dá)會導(dǎo)致嚴(yán)重的病理性肥大。一致的，Sadek 研究團(tuán)隊也證明了強(qiáng)制表達(dá)激活的 Calcineurin 會導(dǎo)致心肌細(xì)胞增生過早轉(zhuǎn)變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大，而抑制 Calcineurin 則延長了心肌細(xì)胞的增殖期。

圖 7. CnA-Tg 心臟顯示 LVEF 明顯降低，

并伴有明顯的疤痕

【CnA-Tg：Ppp3ca (編碼 CnA) 基因持續(xù)活躍表達(dá)；Rcan1-Tg：Rcan1 (表達(dá)內(nèi)源性 Calcineurin 抑制物) 基因持續(xù)活躍】

結(jié)論

研究確定了 Hoxb13 是心肌細(xì)胞分化和增殖的重要調(diào)節(jié)因子，證明了 Meis1 和 Hoxb13 協(xié)同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞成熟和細(xì)胞周期，并且發(fā)現(xiàn)了 Calcineurin 在調(diào)控中重要的作用，靶向 Calcineurin-Hoxb13 軸可能有助于治愈心臟損傷。

 

 

相關(guān)產(chǎn)品

Tamoxifen	口服有效的，選擇性雌激素受體 (estrogen receptor) 調(diào)節(jié)劑 (SERM)�？烧T導(dǎo) Hoxb13 基因缺失。
Voclosporin	鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 抑制劑。
Fenvalerate	鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (Calcineurin; PP2B)  抑制劑，對 PP2B-Aα 的 IC50 為 2-4 nM。
Cyclosporin A	免疫抑制劑，能與親環(huán)素結(jié)合，抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 活性的 IC50 值為 7 nM。
Tacrolimus	大環(huán)內(nèi)酯類，與 FK506 結(jié)合蛋白 (FKBP) 結(jié)合形成復(fù)合物并抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) ，從而抑制 T 淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和 IL-2 轉(zhuǎn)錄。具有強(qiáng)免疫抑制特性。
Tacrolimus monohydrate
Omecamtiv mecarbil	心臟特異性的肌球蛋白 (cardiac myosin) 激活劑。
Mavacamten	心肌肌球蛋白的調(diào)節(jié)劑，其在牛心臟和人心臟中的 IC50 值分別為 490，711 nM。
Danicamtiv	心臟肌動蛋白 (cardiac myosin) 的選擇性變構(gòu)活化劑。
Protease Inhibitor Cocktail	蛋白酶抑制劑 Cocktail 可以用于細(xì)胞或組織提取物用來增加蛋白穩(wěn)定性。
Protease Inhibitor Cocktail,  mini-Tablet
Phosphatase Inhibitor  Cocktail I	磷酸酶抑制劑 Cocktail I/ II/ III 廣譜性抑制酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs)，用于維持蛋白的磷酸化狀態(tài)。
Phosphatase Inhibitor  Cocktail II
Phosphatase Inhibitor  Cocktail III

縮寫：
TALE：Three amino acid loop extension
Meis1：Myeloid ecotrophic insertion site 1
NFAT：Nuclear factor of activated T cells
CSA：Cardiomyocyte cross-sectional area
MI：Myocardial infarction
LVEF：Left-ventricle ejection fraction


原文閱讀 ： Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.

參考文獻(xiàn) 

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1. Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.

2. Shalini A. Muralidhar, et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature volume 497, pages249–253(2013).
3. Satwat Hashmi, et al. Molecular switch model for cardiomyocyte proliferation. Cell Regen. 2019 Jun; 8(1): 12–20.
4. Jiqiang Yao, et al. The Homeobox gene, HOXB13, Regulates a Mitotic Protein-Kinase Interaction Network in Metastatic Prostate Cancers. Sci Rep. 2019 Jul 4; 9(1): 9715.
5. Hui-Bin Liu, et al. Calcineurin and electrical remodeling in pathologic cardiac hypertrophy. Trends Cardiovasc Med. 2010 Jul; 20(5): 148-53.
6. Benjamin J Wilkins, et al. Calcium-calcineurin signaling in the regulation of cardiac hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Oct 1; 322(4): 1178-91.