背景

膜蛋白是生物膜功能的主要執(zhí)行者，在生物體內(nèi)參與許多重要的生理過程。但是，由于很難獲得穩(wěn)定均勻且維持膜蛋白正確構(gòu)象的膜模擬環(huán)境，膜蛋白研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于水溶性蛋白。磷脂納米盤（Nanodisc）是由高密度脂蛋白發(fā)展而來的用于膜蛋白研究的新類型膜結(jié)構(gòu)。將膜蛋白與Nanodisc組裝起來，是膜蛋白研究的有效方法。制備納米盤的一種常用方法是將苯乙烯-馬來酸(SMA)添加到完整的細(xì)胞膜上，從而自發(fā)地生成SMA-脂質(zhì)顆粒（SMALP）的納米盤¹。

微流體擴(kuò)散分級(jí)(MDS)使用微流控分析芯片將蛋白質(zhì)樣本送入一個(gè)通道，在這個(gè)通道中，蛋白質(zhì)樣本與輔助流體一起以穩(wěn)定的層流狀態(tài)流動(dòng)，沒有混合。蛋白質(zhì)從一個(gè)流層轉(zhuǎn)移到另一個(gè)流層的唯一途徑是擴(kuò)散，擴(kuò)散的速率與蛋白質(zhì)的大小流體動(dòng)力學(xué)半徑R_h成正比。R_h的改變表明分子結(jié)合事件的發(fā)生。

 

摘要

在本應(yīng)用中采用MDS技術(shù)的Fluidity one-W檢測到了SMALP納米盤的形成，而且揭示了SMA與脂質(zhì)體的比例是如何影響SMALP納米盤的大小，這是表征嵌入膜蛋白的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。

低SMA/脂質(zhì)體比例下，SMALP納米盤開始形成。隨著SMA/脂質(zhì)體比例的升高，單層囊泡開始降解，大的異質(zhì)性SMALP逐漸形成。在更高的SMA/脂質(zhì)體比例下，SMALPs的平均流體動(dòng)力學(xué)半徑（R_h）縮小了4.5倍，這使得其內(nèi)嵌的脂質(zhì)大大減少了。

納米盤這種大小變化極大地改變了內(nèi)嵌膜蛋白周圍的環(huán)境，因此在生物物理和生化應(yīng)用中需要加以考慮。

因此，對于研究或使用SMALPs，以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整SMALP大小的研究人員來說，F(xiàn)luidity one-W是一個(gè)理想的工具。

方法

1.制備熒光標(biāo)記的脂囊泡

1-棕櫚�；�-2-油酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿(POPC)和1-棕櫚酰-2-(二吡啶甲基硼二氟)十一烷基酰-SN-甘油-3-磷酸膽堿(TopFluor® PC; both Avanti Polar Lipids)混合，得到1 mol% 的TopFluor PC。

氯仿蒸發(fā),脂質(zhì)膜干燥過夜，加入PBS緩沖(pH值7.4)，得到總脂質(zhì)濃度10mM。10 mM脂質(zhì)(POPC / TopFluor PC 1 mol%)穿過孔隙大小100 nm的聚碳酸酯膜30次，得到熒光標(biāo)記大單層囊泡(LUVs)。

通過動(dòng)態(tài)光散射分析得到的熒光標(biāo)記LUVs，其z-平均流體動(dòng)力學(xué)直徑為118±7 nm，多分散性指數(shù)為0.2±0.08。

2.制備SMALP納米盤

PBS (pH7.4)稀釋苯乙烯-馬來酸(SMA 3:1)共聚物原液。為分析納米盤的形成，將LUVs與SMA以不同比例混合，在21℃溫度下孵育至少2小時(shí)。Fluidity One-W檢測樣品。

結(jié)果

在微流控芯片上，當(dāng)樣品通過芯片時(shí)，記錄未擴(kuò)散樣品(F_undiffused)和擴(kuò)散樣品(F_diffused)的熒光強(qiáng)度。

沒有加入SMA時(shí)，完整LUVs的熒光信號(hào)比(SR)，SR=F_diffused/F_undiffused，為~0.15，為低擴(kuò)散水平。

 

相比之下，在SMA存在的情況下，熒光SR值為0.75，表明大的LUV轉(zhuǎn)化為小得多的微小納米盤，引起了更高水平的擴(kuò)散。

 

為了分析SMA與脂質(zhì)的比例如何影響SMALP納米盤的大小，不同濃度(25 µM, 50 µM 和100 µM)的熒光標(biāo)記LUVs與SMA混合。

當(dāng)SMA/脂質(zhì)≥0.08時(shí)，SR的增加表明SMA從LUVs中提取脂質(zhì)，形成小顆粒物，與完整的LUVs共存。

SMA /脂質(zhì)= 0.15時(shí)， LUV完全溶液化²。根據(jù)Fluidity one-W檢測結(jié)果，SMA /脂質(zhì)= 0.15時(shí)， SMALP納米盤平均R_h是20 nm；隨著SMA比例的提高，最小R_h為4.5 nm 。

根據(jù)測量的Rh值，確定了納米盤的半徑(R_disc) ³。假設(shè)POPC-雙分子層厚度為4 nm⁴，那么R_h值為20 nm和4.5 nm時(shí)，R_disc值分別為26 nm和5 nm。

這種R_disc的變化可直接轉(zhuǎn)化為嵌入的脂質(zhì)的數(shù)量。

 

 

 

結(jié)論

Fluidity one-W利用MDS技術(shù)，直接在溶液中檢測分子結(jié)合事件，是一種通過微量樣品檢測SMALP納米盤形成的理想工具。SMALP納米盤的平均流體動(dòng)力學(xué)半徑根據(jù)SMA/脂質(zhì)比例不同從20 nm到4.5 nm不等。這種大小的變化將顯著改變?nèi)魏吻度氲鞍字車�的脂質(zhì)環(huán)境，因此在納米盤研究中至關(guān)重要。

采用微流控?cái)U(kuò)散（MDS）技術(shù)的Fluidity one-W是一款非常實(shí)用的分子互作儀。研究人員可以在溶液中以及在復(fù)雜的生物學(xué)背景（例如粗裂解液或血漿中）研究蛋白質(zhì)相互作用。還可以分析難以研究的蛋白質(zhì)(例如膜蛋白質(zhì)，多蛋白質(zhì)復(fù)合物和固有紊亂的蛋白質(zhì))的相互作用，其中許多蛋白質(zhì)都是重要的藥物靶標(biāo)。此外，由于它報(bào)告了結(jié)合和未結(jié)合物質(zhì)的絕對大小，因此可以與結(jié)合親和力同時(shí)評(píng)估化學(xué)計(jì)量和結(jié)合性質(zhì)，從而全面了解結(jié)合事件。

 

 

 

//親和力檢測

//蛋白穩(wěn)定性檢測

//化學(xué)計(jì)量參數(shù)檢測

//直接檢測血清中抗體濃度和親和力

//膜蛋白分子互作最佳檢測方法

//在溶液中直接檢測，更接近天然狀態(tài)

//非表面結(jié)合原理，無需擔(dān)心非特異性結(jié)合

//兼容細(xì)胞裂解液、培養(yǎng)基、血清等復(fù)雜的溶液背景

參考文獻(xiàn)

1、Dörr,      J.M.; Scheidelaar, S.; Koorengevel, M.C.; Dominguez, J.J.; Schäfer, M.;      van Walree, C.A.; Killian, J.A. The Styrene-Maleic Acid Copolymer: A      Versatile Tool in Membrane Research. Eur Biophys J Biophy. 2016, 45, 3-21.      (publication)

2、Vargas,      C.; Cuevas Arenas, R.; Frotscher, E.; Keller, S. anoparticle self-assembly      in mixtures of phospholipids with styrene/maleic acid copolymers or      fluorinated surfactants. Nanoscale.      2015,      7, 20685-20696. (publication)

3、Glover,      K.J.; Whiles, J.A.; Wu, G.; Yu, N.; Deems, R.; Struppe, J.O.; Stark, R.E.;      Komives, E.A.; Vold, R.R. Structural evaluation of phospholipid bicelles      for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 2001, 81,      2163-2171. (publication)

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