細(xì)胞內(nèi)pH在各種細(xì)胞事件中起重要的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)，鈣調(diào)節(jié)，酶活性，受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，離子轉(zhuǎn)運(yùn)，內(nèi)吞作用，趨化作用，細(xì)胞粘附等等。借助pH敏感的熒光指示劑，研究人員能夠以更高的靈敏度、空間分辨率、采樣密度來監(jiān)控活細(xì)胞內(nèi)的pH波動(dòng)。

 

通常，細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH在其各個(gè)細(xì)胞區(qū)室之間會(huì)有所不同。例如，胞質(zhì)溶膠的pH值介于6.8至7.4之間，而酸性細(xì)胞器（如溶酶體）的pH值介于4.5至6.0之間。因此，選擇pH指示劑時(shí)，重要的是使其酸度系數(shù)（pKa）與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的pH相匹配，我們提供多種熒光pH指示劑，pH指示劑葡聚糖結(jié)合物和其他試劑，用于生物系統(tǒng)中的pH的檢測(cè)。

 

1. 近中性pH的檢測(cè)

 

BCECF及其膜滲透性AM酯是用于測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的最廣泛使用的熒光pH指示劑。它的pKa約為6.98，非常適合測(cè)量各種細(xì)胞類型的胞質(zhì)中的pH變化，以及監(jiān)測(cè)近中性環(huán)境中的pH變化。BCECF在〜504 nm處有一個(gè)最大吸收，在〜440 nm處有一個(gè)等吸收點(diǎn)，在〜527 nm處有最大發(fā)射。盡管BCECF具有雙重激發(fā)的比值特性，但一些特性使比值成像不理想。其等吸收點(diǎn)與最大激發(fā)之間距離較大，細(xì)胞內(nèi)保留性較差以及在440 nm處的弱吸收，都導(dǎo)致其信噪比較低。此外，BCECF以異構(gòu)體的復(fù)雜混合物形式提供。

 

RatioWorks™BCFL，BCECF的高性能替代產(chǎn)品

 

RatioWorks™BCFL是AAT Bioquest設(shè)計(jì)的新型比值型指示劑，用于優(yōu)化BCECF的不良性能和異構(gòu)變異性，與BCECF相似，RatioWorks™BCFL的pKa約為7，最大吸收在503 nm處，最大發(fā)射在528 nm處。但是，RatioWorks™BCFL具有約454 nm的等吸收點(diǎn)，等吸收點(diǎn)的這個(gè)紅移非常適合比值成像，因?yàn)樗�使RatioWorks™BCFL產(chǎn)生的信噪比明顯高于BCECF。

 

RatioWorks™BCFL比值型成像技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定基本上獨(dú)立于幾個(gè)可變因素，包括染料濃度，光程長(zhǎng)度，細(xì)胞滲漏和光漂白速率。RatioWorks™BCFL可以作為不滲透膜的酸使用，也可以作為胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯用于標(biāo)記抗體和蛋白質(zhì)。

 

BCFL激發(fā)光譜	BCFL發(fā)射光譜

 

RatioWorks™BCFL的主要功能：

 

適用于細(xì)胞內(nèi)pH的單波長(zhǎng)成像和比值型成像

信噪比較BCECF高

改善了細(xì)胞保留能力，將背景干擾降至最低

單一異構(gòu)體設(shè)計(jì)可提供更一致和可重現(xiàn)的結(jié)果

適用于熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀和基于熒光酶標(biāo)儀的測(cè)定

 

圖1. 使用RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）和BCECF，AM（Cat# 21202）產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將Hela細(xì)胞與5 µM RatioWorks™BCFL，AM在37°C下孵育30分鐘。用Spexyte™ Intracellular pH Calibration Buffer Kit（Cat# 21235）中的細(xì)胞外緩沖液固定細(xì)胞內(nèi)pH在4.5-8.5之間，取4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值，并用4參數(shù)擬合曲線，得到pH 6到8的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

pH 6.0	pH 8.5

 

圖2. 用RatioWorks™BCFL，AM標(biāo)記的Hela細(xì)胞。將Hela細(xì)胞與5 µM RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）在37°C 下孵育30分鐘。使用顯微鏡FITC濾光片捕獲圖像。將BCFL，AM溶液與Hela細(xì)胞一起溫育，結(jié)果顯示RatioWorks™BCFL，AM和染色的細(xì)胞質(zhì)均被均勻攝取。

 

表1. 接近中性pH環(huán)境的比值型熒光pH探針

 

指示劑	Ex（nm）	Em（nm）	pKa	規(guī)格	貨號(hào)
RatioWorks™BCFL，AM	454、503	528	〜7	1mg	21190
RatioWorks™BCFLAcid	454、503	528	〜7	1mg	21189
RatioWorks™BCFL，SE	454、503	528	〜7	1mg	21191
Cell Meter™熒光細(xì)胞內(nèi)pH檢測(cè)試劑盒	430、505	535	〜7	1000 Tests	21180
CytoFix™BCECF，AM *長(zhǎng)期細(xì)胞pH示蹤劑*	440、504	527	〜6.98	1mg	21202
BCECF，AM	440、504	527	〜6.98	1mg	21202
BCECF，AM *超純級(jí)*	440、504	527	〜6.98	20x50 µ	21203
BCECF acid * CAS＃：85138-49-4 *	440、504	527	〜6.98	1mg	21201

2. 酸性pH檢測(cè)和內(nèi)吞

 

嗜酸探針，例如PDMPO和AAT Bioquest Protonex™染料，具有獨(dú)特的特性，非常適合測(cè)量活細(xì)胞中偏酸性的細(xì)胞器的pH。作為弱堿，由于質(zhì)子化這些染料能夠選擇性地在溶酶體和其他酸性隔室內(nèi)積累。這種質(zhì)子化不僅減少了背景干擾，還激活了其pH依賴性的熒光。

 

RatioWorks™PDMPO，雙重激發(fā)|雙重發(fā)射比值型pH探針

 

RatioWorks™PDMPO是具有酸性雙激發(fā)和雙發(fā)射pH探針， 它的pKa〜4.47和獨(dú)特的pH依賴性熒光是測(cè)量酸性細(xì)胞器pH的理想選擇。在接近中性的條件下，當(dāng)以最大激發(fā)光（〜333 nm）激發(fā)時(shí)，RatioWorks™PDMPO會(huì)在〜450 nm處發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。然而，在更酸性的環(huán)境中，該熒光在〜550 nm處迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S色。RatioWorks™PDMPO在〜386 nm處也表現(xiàn)出二次激發(fā)最大值。這使得能夠在配備有紫色激光的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)pH測(cè)量。RatioWorks™PDMPO已成功地用作生物硅化過程中的示蹤劑，并已廣泛應(yīng)用于二氧化硅相關(guān)研究中。

 

PDMPO激發(fā)光譜	PDMPO發(fā)射光譜

 

Protonex™染料，酸性pH指示劑

 

Protonex™Green 500和Protonex™Red 600是AAT Bioquest開發(fā)的新型pH敏感熒光染料，用于監(jiān)測(cè)酸性細(xì)胞區(qū)室（例如內(nèi)體和溶酶體），從而減少了信號(hào)變異性并提高了準(zhǔn)確性。在接近中性的環(huán)境中，Protonex™染料基本上是無熒光的。直到暴露在酸性環(huán)境中，Protonex™染料的熒光強(qiáng)度才會(huì)增加。Protonex™Green 500的最佳激發(fā)和發(fā)射最大值分別為〜445 nm和〜503 nm，而Protonex™Red 600在〜575 nm處激發(fā)并在〜597 nm處發(fā)射。Protonex™染料可以作為胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯用于標(biāo)記蛋白質(zhì)和抗體，也可以與葡聚糖或乳膠珠偶聯(lián)以研究?jī)?nèi)吞途徑。

 

Protonex™Green 500激發(fā)光譜	Protonex™Red 600發(fā)射光譜

 

Protonex™染料的主要特點(diǎn)：

Protonex™Green 500和Protonex™Red 600的pKa約為6.5

Protonex™染料在中性pH下不發(fā)熒光，隨著酸化作用熒光強(qiáng)度增加

成功追蹤活細(xì)胞內(nèi)化作用并監(jiān)測(cè)吞噬和內(nèi)吞途徑

在中性pH值下染料熒光最弱，無需清洗步驟

適用于與其他熒光染料和綴合物的多重分析

用于熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，熒光計(jì)等

 

圖3.通過Protonex™Red 600-Latex珠綴合物（Cat# 21209）檢查了RAW 264.7細(xì)胞中的吞噬作用。將RAW 264.7細(xì)胞與Protonex™600 Latex Beads在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育4小時(shí)。CytoTrace™Green CMFDA（Cat# 22017）用于追蹤活細(xì)胞。使用Keyence熒光顯微鏡拍攝圖像（20X）。

 

 

表2.適用于酸性pH環(huán)境的比值型和單波長(zhǎng)熒光pH指示劑

 

指示劑	Ex（nm）	Em（nm）	pKa	規(guī)格	貨號(hào)
RatioWorks™PDMPO，AM	333	450、531	約4.47	1mg	21204
RatioWorks™PDMPO Dextran * 10,000 MW *	333	450、531	約4.47	1mg	21211
RatioWorks™PDMPO，SE	333	450、531	約4.47	1mg	21210
Protonex™Green 500	445	503	約6.5	1mg	21215
Protonex™Green 500 WS	445	503	約6.5	1mg	21218
Protonex™Green 500，SE	445	503	約6.5	1mg	21216
Protonex™Green 500葡聚糖	445	503	約6.5	1mg	21217
Protonex™紅色600	575	597	約6.5	1mg	21207
Protonex™Red 600，SE	575	597	約6.5	1mg	21208

 

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