表觀遺傳相關(guān)的研究近年來(lái)也是一大研究熱點(diǎn)，我們知道的表觀遺傳修飾有組蛋白修飾，DNA甲基化，RNA甲基化等等。之前的推文也有專門介紹RNA甲基化相關(guān)的研究現(xiàn)狀和優(yōu)勢(shì)http://www.bio-review.com/m6a-rna/，以及相關(guān)的產(chǎn)品推薦http://www.bio-review.com/rna-methylation-studies/。我們力薦的m6A檢測(cè)試劑盒p-9005也因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和性能被廣大研究者偏愛(ài)，也是如今熱賣的產(chǎn)品，而今天小編就給大家復(fù)盤一下關(guān)于p-9005 檢測(cè)m6A甲基化相關(guān)的疑難雜癥和治療方法。

 

 

       一、 相關(guān)概念

 

       RNA甲基化是RNA的可逆翻譯后修飾，其表觀遺傳地影響許多生物過(guò)程。它發(fā)生在不同的RNA中，包括tRNA，rRNA，mRNA，tmRNA，snRNA，snoRNA，miRNA和病毒RNA。不同的RNA-甲基轉(zhuǎn)移酶具備相應(yīng)的催化策略，用于RNA甲基化。

 

       6-甲基腺嘌呤（m6A）是在存在于真核生物的RNA分子中最常見(jiàn)的和豐富的甲基化修飾和占所有RNA甲基化的80％以上。它可以被稱為“第五RNA堿基”并且在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)中具有廣泛的作用。

 

       而我們推薦的p-9005產(chǎn)品是Epigentek公司的力薦產(chǎn)品，Epigentek集團(tuán)公司是全球領(lǐng)先的創(chuàng)新技術(shù)和表觀遺傳學(xué)相關(guān)研究產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)商和供應(yīng)商，專門做表觀遺傳方面產(chǎn)品，可以說(shuō)在表觀遺傳方面，他們是專家。

 

       二、 p-9005產(chǎn)品性能和優(yōu)勢(shì)

 

       性能：EpiQuik™m6A RNA甲基化定量試劑盒（比色）是一整套優(yōu)化的緩沖液和試劑，用于比色定量RNA中的N6-甲基腺苷（m6A或6mA）。它適用于使用從任何物種（例如哺乳動(dòng)物，植物，真菌，細(xì)菌和病毒）中分離的總RNA直接檢測(cè)m6A RNA甲基化狀態(tài)。

 

       EpiQuik™m6A RNA甲基化定量試劑盒優(yōu)勢(shì)：

 

       1. 檢測(cè)物種多樣化，無(wú)物種限制；

       2.操作簡(jiǎn)便快速，3~4h即可完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)

       3. 高靈敏度，其檢測(cè)極限可低至10 pg m6A

       4.獨(dú)特的結(jié)合溶液—可從mRNA和ncRNA（例如tRNA，rRNA和snRNA）中定量m6A

       5.高特異性

       6.帶孔微孔板格式使該測(cè)定靈活用于手動(dòng)或高通量分析。

       7.簡(jiǎn)單，可靠且一致的測(cè)定條件

 

 

       三、p-9005檢測(cè)的疑難雜癥和藥方

 

       1.病癥一：樣本

 

       對(duì)于這個(gè)試劑盒，很多人對(duì)與樣本方面有很多的疑問(wèn)，雖然試劑說(shuō)明書(shū)上說(shuō)可適用任何物種的m6A檢測(cè)，但是同學(xué)們還是有各種各樣的問(wèn)題：

     （1）RNA樣本類型

 

       處方：培養(yǎng)的細(xì)胞，新鮮和冷凍的組織，石蠟包埋的組織，血液，體驗(yàn)等等樣本的總RNA，mRNA，tRNA，rRNA和snRNA均可適用該試劑盒。

 

     （2）RNA樣本提取方式

 

       處方：市面上銷售的試劑盒提取的均可，Trizol法可能是可以的，但是Trizol法提取的請(qǐng)確保提取后將RNA重新溶解在不含RNase的水中或合適的緩沖液（例如TE）中，并且RNA質(zhì)量高且相對(duì)不含DNA。

 

     （3）RNA樣本符合要求的標(biāo)準(zhǔn)

 

       處方：OD 260/280 >1.9。260/230 > 1.7 【無(wú)DNA污染】

 

       2.病癥二: 對(duì)照

 

       關(guān)于試劑盒中的對(duì)照方面，也是有很多同學(xué)問(wèn)詢。

 

     （1）陽(yáng)性對(duì)照怎么設(shè)置

 

       對(duì)于第一次上手做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的同學(xué)們或許都會(huì)有些疑惑，陽(yáng)性對(duì)照難道不都是要做標(biāo)準(zhǔn)曲線的嗎？不然怎么對(duì)照和計(jì)算呢？

 

       處方：其實(shí)，這個(gè)試劑盒是可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇做單點(diǎn)對(duì)照（0.5ng/ml）還是做標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.02~1ng/ml）。建議做復(fù)孔喲。

 

     （2）陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)太弱

 

       處方：【1】添加至孔中的PC量不足，確保加入足夠量的PC；【2】標(biāo)準(zhǔn)液未進(jìn)行最佳稀釋，并充分混合；【3】確保PC的保存方式是按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行保存的，一定要保存在指定條件下喲，【4】在使用的時(shí)候，要注意稀釋后放置在冰上，保證有效成分不被講解。

 

     （3）陰性對(duì)照背景值太高

 

       處方：【1】可能沒(méi)有洗干凈，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行清洗；【2】被PC或者樣本污染了，切記要換槍頭加樣；【3】孵育時(shí)間太長(zhǎng)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作1~10min，最長(zhǎng)也不能超過(guò)2h；【4】顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可適當(dāng)縮減顯色時(shí)間。

 

    （4）樣本值太低或者沒(méi)信號(hào)

 

      處方：

 

      【1】可能是因?yàn)闆](méi)有加入足夠量的RNA。廠家推薦的樣本輸入量為100ng~300ng，200ng為最佳，但是這又不是絕對(duì)的噢，同學(xué)們可根據(jù)自己的樣本做相應(yīng)的調(diào)整尤其在信號(hào)偏弱的情況下，可適當(dāng)上調(diào)RNA的輸入量。

 

     【2】可能是因?yàn)楫a(chǎn)品本身m6A的含量就很低。

 

     【3】可能是樣本的純度不夠，有DNA或者其他的污染，或者RNA發(fā)生了降解，這些都可能造成低信號(hào)。

 

      【4】mRNA樣本的話，可能因?yàn)槠�段太�。?lt;80 nts）,也會(huì)導(dǎo)致低信號(hào)。

 

       3.病癥三：數(shù)據(jù)分析

 

     （1）如何計(jì)算標(biāo)曲

 

       處方：線性回歸，二階多項(xiàng)式，四參數(shù)對(duì)數(shù)回歸都可以。

 

 

    （2）不同輸入量檢測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)是否可一同進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?

 

       處方：是可以的，但是要注意計(jì)算的時(shí)候要以不同的數(shù)據(jù)進(jìn)行。比如你第一次的樣本輸入量是200ng，計(jì)算公式帶入的值為200；第二次樣本輸入量是300ng，計(jì)算公式帶入的值必須為300.

 

     （3）什么情況下的樣本OD值被認(rèn)為是可用的？

 

       處方：只要樣品的OD高于NC的數(shù)值，該數(shù)據(jù)仍可用于計(jì)算m6A水平。

 

     （4）重復(fù)孔之間差異較大怎么計(jì)算？

 

       處方：對(duì)于重復(fù)孔之間差異較大，我們?nèi)羰侵貜?fù)孔3個(gè)以上的話，我們一般會(huì)選擇舍棄其中差異特別特別大的一個(gè)值后再進(jìn)行計(jì)算，但是只有2個(gè)孔的話，該怎么辦呢？這個(gè)時(shí)候我們不能隨便舍棄任何一個(gè)孔的值，同樣也沒(méi)有辦法提供相關(guān)的建議。但是需要注意：p-9005比色測(cè)定的%CV約為15%。

 

       4.病癥四：稀釋

 

     （1）需要稀釋的試劑組分如何稀釋？

 

       處方：按照說(shuō)明書(shū)上給的配制比例進(jìn)行稀釋，用TE buffer稀釋，建議即用即配，計(jì)算好所需的量再進(jìn)行稀釋配制。

 

     （2）為什么有些組分稀釋后需要放置在冰上？

 

       處方：使用前應(yīng)將稀釋的成分（例如PC標(biāo)準(zhǔn)品）放在冰上，以最大程度地減少試劑降解并保持試劑完整性。

 

     （3）稀釋液必須是TE嗎？可以替換成DEPC水或者無(wú)RNAase的水嗎？

 

       處方：可以使用DEPC水替代TE buffer，無(wú)RNAase的水也可以。

 

       5.其他

 

      （1）所有組分需要放置在室溫條件下回溫嗎？

 

       處方：對(duì)于產(chǎn)品組份中的Wash buffer，保存在低溫下可能會(huì)有鹽離子等沉淀，在使用前需要將其拿至室溫進(jìn)行回溫，沉淀即可溶解，這樣可進(jìn)行正常的實(shí)驗(yàn)。

 

     （2）如何減少?gòu)?fù)孔間差異？

 

       處方：

 

       【1】在板中垂直而不是水平地加載復(fù)制樣品，因?yàn)檫@可以確保同時(shí)添加溶液以復(fù)制孔，并有助于最小化復(fù)制差異。

 

       【2】確保從孔中完全去除洗滌緩沖液，因?yàn)槿魏螝埩舻木彌_液都會(huì)增加背景信號(hào)和重復(fù)變異性，尤其是在敏感的ELISA中（例如用于甲基化檢測(cè)的ELISA）。

 

       【3】使用手動(dòng)移液器代替典型的板輕拂/傾倒方法，以確保完全去除緩沖液并最大程度減少孔間污染。

 

       （3）有相關(guān)的參考文獻(xiàn)嗎？

       

       說(shuō)道參考文獻(xiàn)，不僅有，而且非常多，還是處于實(shí)時(shí)更新的狀態(tài)，日期都非常的新（https://www.epigentek.com/catalog/epiquik-m6a-rna-methylation-quantification-kit-colorimetric-p-3646.html）：

 

       Tsuruta K. et. al. et. al. (September 2020). RNA N6-methyladenosine demethylase FTO regulates PD-L1 expression in colon cancer cellsBiochemical and Biophysical Research Communications. 530(1)

       Chen S et. al. (August 2020). WTAP promotes osteosarcoma tumorigenesis by repressing HMBOX1 expression in an m⁶A-dependent manner.Cell Death Dis. 11(8):659.

       Xu Y et. al. (August 2020). The FTO/miR-181b-3p/ARL5B signaling pathway regulates cell migration and invasion in breast cancer.Cancer Commun (Lond).

       Du J. et. al. et. al. (August 2020). N 6-Adenosine Methylation of Socs1 mRNA is Required to Sustain the Negative Feedback Control of Macrophage ActivationDevelopmental Cell.

       Zhang S et. al. (August 2020). Pregnancy carbon black nanoparticles exposure-induced neurobehavioral deficits are associated with m6A modification in offspring.

       Yang Z. et. al. et. al. (August 2020). RNA N6-Methyladenosine Reader IGF2BP3 Regulates Cell Cycle and Angiogenesis in Colon CancerGeneral Surgery.

       Zhu S et. al. (July 2020). Dexmedetomidine Suppressed the Biological Behavior of HK-2 Cells Treated with LPS by Down-Regulating ALKBH5.

       Jian D et. al. (July 2020). METTL14 aggravates endothelial inflammation and atherosclerosis by increasing FOXO1 N6-methyladeosine modifications.10(20):8939-8956.

 

       最后，溫馨提示：這個(gè)產(chǎn)品p-9005是有配套的中文說(shuō)明書(shū)的，但是還請(qǐng)各位同學(xué)們拿到產(chǎn)品后，認(rèn)真閱讀英文說(shuō)明書(shū)喔，英文說(shuō)明書(shū)為主，中文說(shuō)明書(shū)為輔。

 

       以上就是小編整理的同學(xué)們常問(wèn)的有關(guān)這個(gè)試劑盒的問(wèn)題，各位同學(xué)若是有以上問(wèn)題，可以借鑒喲~~

 

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