說起免疫印跡（Western Blot）檢測，想必大家都很熟悉了，不就是WB嗎？每天都做啊，白底黑帶，但是最近經(jīng)常閱讀SCI文獻(xiàn)（特別是高分的）小伙伴可能會發(fā)現(xiàn)，近兩年發(fā)表很多高影響因子的文獻(xiàn)的WB結(jié)果圖發(fā)生了大變樣：白底變成了黑底，條帶從黑色變成了：紅，橙，黃，綠，藍(lán)等各種顏色了（如下），條帶亮度，對比度都好了很多了，不同蛋白還能呈現(xiàn)出不同顏色的條帶，很多同學(xué)可能會問，這是什么黑科技？是用分析軟件設(shè)置的顏色嗎？還是PS軟件P出來的了？

 

 

       其實都不是，這是最近比較火的免疫印跡黑科技——熒光WB技術(shù)，這不，很多同學(xué)還在實驗室中苦逼的跑著WB，“為啥背景那么深？為啥沒有目的條帶？為啥分子量不對？為什么對比度這么低？哀怨聲此起彼伏的時候，殊不知，免疫印跡領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)生著一場由“黑白”到“彩色”的光影革命。

 

       熒光WB產(chǎn)生背景：

 

       盡管大多數(shù)生命科學(xué)研究者采用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行檢測，但由于對多重分析的需求不斷增加，現(xiàn)在越來越多的國外科學(xué)家開始使用熒光檢測法。目前國內(nèi)實驗室使用較多的仍是化學(xué)發(fā)光，而SCI期刊中則有很多已經(jīng)使用熒光標(biāo)記WB了，為了緊跟時代的步伐，我們需要引進(jìn)和創(chuàng)新。

 

       常見Western Blot顯色的方法主要有：放射自顯影、底物化學(xué)發(fā)光ECL、底物DAB呈色，熒光WB實驗步驟跟傳統(tǒng)WB差異不大，最主要的差別在于二抗：傳統(tǒng)WB檢測二抗是酶標(biāo)記，而熒光WB的二抗是熒光標(biāo)記的，省去了繁雜的顯影，照膠等步驟，取而代之的是利用熒光成像儀直接成像。

 

 

常規(guī)WB和熒光WB原理對比

 

       說了這么多，那熒光ＷＢ到底好在哪了？

 

       熒光WB的優(yōu)勢：

 

       化學(xué)發(fā)光的信號是動態(tài)的，二抗是酶標(biāo)記，屬于酶促動力學(xué)反應(yīng)，信號隨時間的變化而變化，信號不與目標(biāo)蛋白濃度成線性比例關(guān)系。而熒光信號熒光是靜態(tài)信號，不會隨著時間的變化而變化，信號持久，可達(dá)到精準(zhǔn)定量。

 

       1.靈敏度更高

 

       熒光免疫印跡已被證明比傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光印跡更敏感，這是因為IR區(qū)域膜上的低背景熒光產(chǎn)生高的信噪比。配備有光電倍增管（PMT）的激光掃描成像儀對印跡進(jìn)行成像，并可以將弱信號放大幾個數(shù)量級。

 

       2.通過復(fù)用提高量化精度

 

       使用雙色檢測方法可以同時檢測相同印跡上的兩種抗原。例如，您可以分析您感興趣的蛋白，并利用內(nèi)參蛋白（例如GAPDH，肌動蛋白）將其均一化，而無需剝離/重新檢測印跡或運(yùn)行單獨(dú)的凝膠。因此，您的量化將更準(zhǔn)確。

 

 

雙色檢測

 

       3.廣泛的線性動態(tài)范圍用于定量測量

 

       為了確保可靠的定量測量，您從western blot獲得的信號必須在線性動態(tài)范圍內(nèi)。這意味著信號強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白質(zhì)豐度呈線性相關(guān)。換句話說，信號強(qiáng)度的兩倍增加意味著目標(biāo)蛋白質(zhì)水平增加了兩倍。通過激光成像儀獲得的靜態(tài)熒光值是定量的。這是因為熒光強(qiáng)度與幾個數(shù)量級的蛋白質(zhì)豐度成正比。這提供了廣泛的線性范圍。您可以在相同設(shè)置下量化低豐度和高豐度蛋白質(zhì)，而不用擔(dān)心信號飽和或超出線性范圍。

 

       相比之下，X射線膠片的動力學(xué)酶-底物反應(yīng)和信號飽和將化學(xué)發(fā)光檢測的線性度限制在更小的范圍內(nèi)。您經(jīng)常需要嘗試各種曝光以獲得差異表達(dá)蛋白質(zhì)的“正確圖像”。這是為了確保捕獲的信號在線性范圍內(nèi)。

 

       4.一致性和可重復(fù)性高

 

       熒光信號是僅取決于目標(biāo)抗原的量的靜態(tài)值，而許多變量影響通過膜曝光獲得的化學(xué)發(fā)光信號。一些變量（例如，酶底物反應(yīng)）難以控制導(dǎo)致不一致和不可重復(fù)的結(jié)果。 Schutz-geschwender等（2004）報道了熒光蛋白印跡實驗重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于化學(xué)發(fā)光檢測。因此，為了確保您的免疫印跡結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

 

       5.信號持續(xù)時間長

 

       熒光信號非常穩(wěn)定。您可以將您的印跡存儲在冰箱中，并在您準(zhǔn)備好后再進(jìn)行成像。相比之下，如果您正在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的免疫印跡，您通常需要馬上開始成像。這是為了避免酶活性降低。

 

       傳統(tǒng)WB和熒光WB的綜合比較：

 

	化學(xué)發(fā)光法WB	熒光WB
信號源	酶促反應(yīng)的間接信號（HRP酶標(biāo)二抗+ECL顯色）	熒光基團(tuán)的直接信號（FITC/Dylight/Alexa Fluor熒光二抗）
信號持續(xù)時間	幾分鐘到幾小時	幾天到幾周，避光保存得當(dāng)可長達(dá)一年
靈敏度	高靈敏度，底物種類多樣（DAB、ECL等） 例如ECL顯色，HRP酶標(biāo)二抗1:20000~1:50000	靈敏度較好 例如Dylight熒光二抗 1:10000左右
一致性	印跡間可能存在差異	印跡間的重復(fù)性較高
檢測	膠片、化學(xué)發(fā)光法成像儀器 常見凝膠成像儀器均可	需有合適光源和濾光片的成像儀器，例如li-Cor、Bio-rad、天能等。
定量	定性及半定量，單通道檢測使標(biāo)準(zhǔn)化較為困難	帶有內(nèi)部對照的多重分析技術(shù)使標(biāo)準(zhǔn)化較易實現(xiàn)
其他注意事項	相似分子量需要進(jìn)行剝離和印跡的重新檢測 曝光時間可以較長	需要注意避免熒光背景 由于少量的激發(fā)光會穿過濾光片，因此曝光時間更長會導(dǎo)致背景熒光較高 需要注意避光

 

       話不多說，結(jié)果才是硬道理：

 

 

       骨灰級傳統(tǒng)WB玩家跑出來的條帶應(yīng)該也就左上角的水平了吧？相較于采用熒光WB隨手一跑的結(jié)果（右上圖和下圖），如果你是審稿人，你會pick誰了？

 

 

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