強(qiáng)大的基因組編輯工具-Crisp/cas9
關(guān)于Crisp/cas9，這個(gè)是目前研究的一個(gè)大熱門，相關(guān)的文章和技術(shù)解析層出不窮，大家對(duì)什么是Crisp/cas9應(yīng)該也有了一定的了解，今天就跟大家簡(jiǎn)單的介紹一下相關(guān)的產(chǎn)品吧。不過(guò)首先，我們還是再過(guò)一遍Crisp/cas9的相關(guān)概念吧。
一、 相關(guān)概念
（1）CRISPR/Cas是什么？CRISPR是細(xì)菌中成簇存在的具有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。cas 的全稱是CRISPR associated protein，它是一種通過(guò)crRNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶，如果DNA底物與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)，Cas就會(huì)裂解入侵的外源DNA。
（2）CRISPR和Cas9共同組成了一套系統(tǒng) ，CRISPR識(shí)別外源入侵的DNA，cas9負(fù)責(zé)剪切。是細(xì)菌或者古細(xì)菌的天然防御系統(tǒng)。而現(xiàn)今，被人類利用進(jìn)行基因組編輯、轉(zhuǎn)錄擾亂、基因敲除、表觀遺傳調(diào)控等。
（3）CRISPR-Cas系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被應(yīng)用于多種生物，包括斑馬魚(yú)、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲(chóng)、植物及細(xì)菌。多個(gè)科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比較，CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向?qū)嶒?yàn)在細(xì)胞或斑馬魚(yú)中具有相似甚至更高的效率。
圖1來(lái)源https://www.jianshu.com/p/1e7bff7d5830
二 、作用機(jī)理
II型CRISPR系統(tǒng)中，CRISPR RNA（crRNA）與轉(zhuǎn)錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的復(fù)合物能特異識(shí)別基因組序列，引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。 這個(gè)識(shí)別復(fù)合體可以通過(guò)融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進(jìn)行簡(jiǎn)化�；蚪M的靶序列中有長(zhǎng)約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補(bǔ)配對(duì)；靶序列末端的三核苷酸區(qū)域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識(shí)別位點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)剪切功能的關(guān)鍵。而通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的gRNA (guide RNA) 足以引導(dǎo)Cas9 對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。
圖2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯原理圖
通過(guò)介紹，我們了解了Crisp/cas9發(fā)揮切割作用的是cas9，起識(shí)別作用的是融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA。因此，要想做好Crisp/cas9這個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們必須要準(zhǔn)備的試劑必須涉及sgRNA和cas9蛋白兩大方面。
三、 產(chǎn)品推薦
針對(duì)sgRNA和cas9，我們有如下產(chǎn)品可供選擇哦：
1.sgRNA系列。
（1）sgRNA載體類型
| 貨號(hào) | 載體 | 啟動(dòng)子 | sgRNA | 是否含有Cas9核酸酶基因 | 篩選標(biāo)記/報(bào)告基因 |
| SG001 | pCRISPR-SG01 | U6 | 1 或多個(gè) | 無(wú)，Cas9克隆單獨(dú)出售 | Hygromycin |
| SG002 | pCRISPR-LvSG03 | U6 | 1 或多個(gè) | 無(wú)，Cas9克隆單獨(dú)出售 | Puromycin / mCherry |
| SG012 | pCRISPR-CG02 | U6 | 1 | 有，載體含有CBh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | N/A |
| SG013 | pCRISPR-CG04 | U6 | 1或多個(gè) | 有，載體含有CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | Neomycin / copGFP |
| SG014 | pCRISPR-CG07 | U6 | 1 | 有，載體含有CBh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | copGFP |
| SG015 | pCRISPR-CG08 | U6 | 1 | 有，載體含有CBh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | mCherry |
| — | pCRISPR-CG12 | U6 | 1或多個(gè) | 有，載體含有CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | Neomycin / mCherry |
*配合單獨(dú)表達(dá)Cas9 核酸酶(Cat.No. CP-C9NU-01, CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08, CP-LvC9NU-09, CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01, CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。
還有有上述貨號(hào)對(duì)應(yīng)搭配使用的sgRNA亂序?qū)φ张?/div>
圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個(gè)基因。實(shí)驗(yàn)組（1-4泳道）為Cas9表達(dá)克隆及分別表達(dá)靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。對(duì)照組（5-8泳道）為Cas9表達(dá)克隆質(zhì)及隨機(jī)sgRNA表達(dá)克隆的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。通過(guò)T7核酸內(nèi)切酶檢測(cè)分析基因組DNA各個(gè)靶點(diǎn)上同時(shí)存在的插入缺失。*號(hào)標(biāo)記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA都在目標(biāo)靶點(diǎn)上有效地誘發(fā)了插入缺失突變（1-4道）。PCR產(chǎn)物條帶及T7核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物條帶大�。篏FP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).
作為一家具有高端的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國(guó)。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，為用戶提供專業(yè)的前沿資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶，公司組建了一支經(jīng)驗(yàn)豐富的研發(fā)團(tuán)隊(duì)-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 篩選標(biāo)記 | 報(bào)告基因 |
| CCPCTR01-CG02 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. | N/A |
| CCPCTR01-CG04 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 | |
| CCPCTR01-CG07 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 | |
| CCPCTR01-CG08 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry | |
| CCPCTR01-LvSG03 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 | mCherry |
| CCPCTR01-SG01 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 | N/A |
（2）還有sgRNA亂序?qū)φ章《绢w粒
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 描述 | 啟動(dòng)子 | 篩選標(biāo)記 | sgRNA |
| LPP-CCPCTR01-LvSG03-100 | sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（25 µL×4管） | 108 TU/ml sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí) | EF1a | Puromycin | CCPCTR01-LvSG03 |
| LPP-CCPCTR01-LvSG03-400 | sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（100µL，25 µL×16管） | 108 TU/ml sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí) | EF1a | Puromycin | CCPCTR01-LvSG03 |
圖3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細(xì)胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設(shè)計(jì)；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對(duì)照克隆（泳道2）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40h后收集細(xì)胞，提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠純化PCR產(chǎn)物，將純化后的產(chǎn)物與緩沖液混勻，經(jīng)變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經(jīng)PCR后的產(chǎn)物片段長(zhǎng)度應(yīng)為520bp，T7 ENI剪切后的產(chǎn)物應(yīng)分別為330bp和190bp。
圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個(gè)基因。實(shí)驗(yàn)組（1-4泳道）為Cas9表達(dá)克隆及分別表達(dá)靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。對(duì)照組（5-8泳道）為Cas9表達(dá)克隆質(zhì)及隨機(jī)sgRNA表達(dá)克隆的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。通過(guò)T7核酸內(nèi)切酶檢測(cè)分析基因組DNA各個(gè)靶點(diǎn)上同時(shí)存在的插入缺失。*號(hào)標(biāo)記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA都在目標(biāo)靶點(diǎn)上有效地誘發(fā)了插入缺失突變（1-4道）。PCR產(chǎn)物條帶及T7核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物條帶大�。篏FP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).
（3）sgRNA 文庫(kù)
圖5. A：混合文庫(kù)篩選。對(duì)感染了sgRNA混合文庫(kù)的細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲取具備目的表型的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行Sanger測(cè)序識(shí)別對(duì)應(yīng)的sgRNA，或通過(guò)深度測(cè)序搜索比例過(guò)高或過(guò)低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文庫(kù)array（獨(dú)立克隆文庫(kù)）進(jìn)行基因敲除篩選。各板孔里的細(xì)胞株分別感染不同的sgRNA慢病毒顆粒，并篩選具備目的表型的陽(yáng)性細(xì)胞株。如此無(wú)需測(cè)序即可獲知與目的表型相關(guān)的sgRNA。
人類 sgRNA 文庫(kù)相關(guān)產(chǎn)品
| 貨號(hào) | 文庫(kù) | sgRNA 數(shù)目 | 基因數(shù)目 | 管數(shù) | 載體 |
| L01-LS03 | Innate kinases & ubiquitin ligases | 475 | 239 | 4 管，每管 118-119 個(gè) sgRNA | pCRISPR-LvSG03 |
| L02-LS03 | Nuclear hormone receptors | 236 | 118 | 2 管，每管118 個(gè) sgRNA | pCRISPR-LvSG03 |
| L03-LS03 | Tumor metastasis genes | 114 | 57 | 2 管，每管 57 個(gè) sgRNA | pCRISPR-LvSG03 |
| L04-LS03 | Oncogenes | 576 | 288 | 4 管，每管 144 個(gè) sgRNA | pCRISPR-LvSG03 |
| L05-LS03 | Tumor suppressor genes | 462 | 231 | 4 管，每管 115-116 個(gè) sgRNA | pCRISPR-LvSG03 |
| L06-LS03 | Protein kinases | 1316 | 658 | 10 管，每管 130-131 個(gè) sgRNAs | pCRISPR-LvSG03 |
| L07-LS03 | Key genes in 50 pathways | 278 | 139 | 2 管，每管 139 個(gè)sgRNA | pCRISPR-LvSG03 |
2.Cas9系列產(chǎn)品
（1）Cas9表達(dá)克隆產(chǎn)品
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 |
| Cas9核酸酶表達(dá)克隆 | |||
| CP-C9NU-01 | Cas9核酸酶表達(dá)克隆 | CMV | mCherry / Neomycin |
| Cas9核酸酶慢病毒表達(dá)克隆 | |||
| CP-LvC9NU-01 | Cas9核酸酶慢病毒表達(dá)克隆 | CMV | Neomycin |
| CP-LvC9NU-02 | Cas9核酸酶慢病毒表達(dá)克隆 | CMV | eGFP / Neomycin |
| CP-LvC9NU-08 | Cas9核酸酶慢病毒表達(dá)克隆 | EF1a | Puromycin |
| CP-LvC9NU-09 | Cas9核酸酶慢病毒表達(dá)克隆 | EF1a | eGFP / Neomycin |
| CP-LvC9NU-10 | Cas9核酸酶慢病毒表達(dá)克隆 | EF1a | eGFP / Hygromycin |
| Cas9 D10A 切口酶表達(dá)克隆 | |||
| CP-C9NI-01 | Cas9 D10A 切口酶表達(dá)克隆 | CBh | N / A |
| CP-C9NI-02 | Cas9 D10A 切口酶表達(dá)克隆 | CMV | mCherry / Neomycin |
（2）慢病毒顆粒類產(chǎn)品
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 描述 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 |
| LPP-CP-LvC9NU-01-100 | Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 | 1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)，100 µL. | CMV | Neomycin |
| LPP-CP-LvC9NU-02-100 | Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 |
1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)，100 µL. |
CMV | eGFP/Neomycin |
| LPP-CP-LvC9NU-10-400 | Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 | 不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)，400 µL. | EF1α | eGFP/Hygromycin |
| LPP-CP-LvC9NU-08-100 | Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 | 不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)，100 µL. | EF1α | Puromycin |
（3）GeneHero™ Cas9 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系
| 新貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 細(xì)胞系 | Cas9 整合位點(diǎn) | 產(chǎn)品規(guī)格 |
| SL501 | 穩(wěn)定表達(dá) Cas9 核酸酶基因的人類 H1299 單克隆細(xì)胞系 | H1299 | AAVS1 | 1管，每管細(xì)胞數(shù)2×106 |
| SL502 | 穩(wěn)定表達(dá) Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T 單克隆細(xì)胞系 | HEK293T | AAVS1 | 1管，每管細(xì)胞數(shù)2×106 |
| SL503 | 穩(wěn)定表達(dá) Cas9 核酸酶基因的 人類 HeLa 單克隆細(xì)胞系 | HeLa | AAVS1 | 1管，每管細(xì)胞數(shù)2×106 |
| SL520 | 穩(wěn)定表達(dá) Cas9 核酸酶基因的人類AGS單克隆細(xì)胞系 | AGS | 隨機(jī)整合 | 1管，每管細(xì)胞數(shù)2×106 |
| SL522 | 穩(wěn)定表達(dá) Cas9 核酸酶基因的人類SNU475單克隆細(xì)胞系 | SNU475 | 隨機(jī)整合 | 1管，每管細(xì)胞數(shù)2×106 |
(4）GeneHero™ Cas9蛋白類產(chǎn)品
| 貨號(hào) | 規(guī)格 | 產(chǎn)品 |
| GE001 | 25μg | 重組Cas9蛋白含NLS |
| GE002 | 100μg | 重組Cas9蛋白含NLS |
| GE003 | 25μg | 重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag |
| GE004 | 100μg | 重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag |
圖6. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。針對(duì)HUWE基因設(shè)計(jì)3個(gè)sgRNA，分別與Cas9蛋白孵育后進(jìn)行下一步切割實(shí)驗(yàn)。紅點(diǎn)標(biāo)注為切割后的DNA條帶，Ct為未切割的HUWE DNA片段
圖7. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。sgRNA與Cas9蛋白孵育后進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)。GeneHero™ Cas9蛋白（3-5列）與IDT Alt-R® Cas9蛋白（6-7列）分別進(jìn)行250ng，100ng和50ng稀釋反應(yīng)。紅箭頭標(biāo)注為切割后的DNA條帶，1列反應(yīng)中只有Cas9，2列反應(yīng)中只有sgRNA。
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