提到克隆、重組載體，就想到5字金言：分、切、連、轉(zhuǎn)、篩，“分”是指分離制備合格的待操作的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；“轉(zhuǎn)”是指通過轉(zhuǎn)染的方法將重組的DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；“篩”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的克隆。實(shí)驗(yàn)具體怎么做，細(xì)節(jié)大體是沒印象了，但是這5個(gè)字卻記得真真切切，都是血淚的教訓(xùn)，現(xiàn)在說起來貌似很簡單，誰知道當(dāng)初這5步歷經(jīng)了多少次煉獄循環(huán)。

 

       沒錯(cuò)，在過去數(shù)十年，用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，在DNA連接酶的作用下，連接兩個(gè)甚至更多片段的克隆方法，是載體構(gòu)建的經(jīng)典方案。但是現(xiàn)如今我們再提到克隆的時(shí)候，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不再只有傳統(tǒng)的限制酶克隆一種選擇。其中Gateway克隆技術(shù)作為一種可以快速、高效將DNA序列轉(zhuǎn)移到載體上的克隆方法已經(jīng)流行開來。不要覺得Gateway克隆技術(shù)高深莫測，其實(shí)了解一下你就能懂。

 

       Gateway克隆方法是λ噬菌體感染細(xì)菌時(shí)發(fā)生的整合和切割重組反應(yīng)的體外形式。在體內(nèi)，噬菌體（attP）和細(xì)菌（attB）的附著位點(diǎn)發(fā)生重組反應(yīng)，噬菌體整合到細(xì)菌基因組中，兩側(cè)為兩個(gè)新的重組位點(diǎn)（attL-left-和attR-right-）。在某些條件下，attL和attR位點(diǎn)可以重組，導(dǎo)致噬菌體從細(xì)菌染色體上切除并重新生成attP和attB位點(diǎn)。

 

 

       即Gateway技術(shù)依賴于下面描述的兩個(gè)反應(yīng)：BP反應(yīng)和LR反應(yīng)，通過BP反應(yīng)獲得入門克隆(有時(shí)候我們也說中間克隆)，再通過LR反應(yīng)將目的DNA以正確的方向連接到各種目的載體上，形成不同的表達(dá)載體。GeneCopoeia提供的 EZShuttle™重組克隆體系應(yīng)用E.coli和λ噬菌體特異位點(diǎn)的重組酶促體系使 DNA片段在載體間相互轉(zhuǎn)換，其原理與 Gateway克隆技術(shù)相同。

 

       BP反應(yīng)-構(gòu)建入門載體：

 

       通過PCR將attB位點(diǎn)添加到目的DAN序列兩側(cè)，形成attB-PCR產(chǎn)物。用attB-PCR產(chǎn)物或者含attB位點(diǎn)的供體質(zhì)粒和含attP位點(diǎn)的質(zhì)粒發(fā)生重組生成入門克隆。

 

 

貨號(hào)	名稱	說明
RCBM-1002-020	EZRecombinase™ BP Cloning Kit (20 rxn)	Catalyzes attB x attP cloning（催化BP反應(yīng)）
RCBM-1002-100	EZRecombinase™ BP Cloning Kit (100 rxn)	Catalyzes attB x attP cloning（催化BP反應(yīng)）

       LR反應(yīng)-構(gòu)建表達(dá)載體：

 

       制作表達(dá)載體時(shí)，選擇適合的目標(biāo)載體非常重要。這種選擇取決于許多因素，如宿主類型，所需的表達(dá)水平和實(shí)驗(yàn)?zāi)康�。選定的attR表達(dá)載體與attL-入門載體重組以產(chǎn)生表達(dá)載體。

 

 

       
       除了可以提供載體構(gòu)建的BP Mix和LR Mix，GeneCopoeia還可提供40,000多種人和小鼠不同載體的即用型ORF表達(dá)克隆（可直接用于體內(nèi)或體外不同宿主或表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)，省卻克隆構(gòu)建步驟），以及20,000種人和15,000小鼠Gateway PLUS入門克�。ㄟ�需要進(jìn)行亞克隆，將ORF序列轉(zhuǎn)移到表達(dá)克隆中）。你的基因我承包，不管你是需要構(gòu)建好的表達(dá)克隆，還是入門克隆，不要猶豫，請聯(lián)系艾美捷科技，全方位科研需求的表達(dá)系統(tǒng)以及眾多的融合標(biāo)簽可以滿足您的花樣需求

 

       全方位科研需求的表達(dá)系統(tǒng)

 

       
       眾多的融合標(biāo)簽

 

熒光蛋白標(biāo)簽	eGFP、eYFP、eCFP、mCherry
多功能標(biāo)簽	HaloTag®、AviTag™、SNAP- Tag™
促溶解度標(biāo)簽	His、Trx、SUMO、GST、MBP
抗體免疫共沉淀標(biāo)簽	HA、Flag、cMyc

 

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