TF/TQ染料標(biāo)記MMP和酪蛋白的肽序列實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果
材料和方法
所有肽均采用公司標(biāo)準(zhǔn)FMOC化學(xué)合成。一些TF肽是用FMOC-Lys（TF）-OH、FMOC-Asp（TF）-OH或FMOC-Glu（TF）-OH氨基酸制備的。在肽的標(biāo)記中，用TF-NHS酯標(biāo)記賴氨酸殘基的N端氨基或ε-氨基。用TF馬來酰亞胺或碘代乙酰胺標(biāo)記巰基半胱氨酸殘基。
TF1，TF2，TF3，TF4，TF5，TF6，TF7和TF8的酸、馬來酰亞胺和NHS酯形式，以及FMOC-Lys（TF2-Boc）-OH，F(xiàn)MOC-Lys（TF3）-OH，F(xiàn)MOC-Asp（TF3）-OH，F(xiàn)MOC-Glu（TF3）-OH等均可從百螢生物獲得。
所有的酶分析都是用從Sigma，R＆D Systems，EMD Chemicals購買的純化酶完成的。使用用日立U-3010拍攝了吸收光譜，終點(diǎn)熒光分析在BMG NovoStar或Gemini SpectraMax（分子設(shè)備）上進(jìn)行，酶動力學(xué)分析在FlexStation分子設(shè)備上進(jìn)行）。
Tide Fluor （TF）染料的光譜特性
我們的TF系列熒光標(biāo)記染料覆蓋了整個可見光譜，具有非常高的標(biāo)記效率。例如，TF2的光譜特性與AF 488、FAM和FITC基本相同。在生理?xiàng)l件下或細(xì)胞內(nèi)，它比熒光素亮3倍，耐光性高4倍。TF染料具有對pH4～pH10的pH波動不敏感的熒光，而FAM和FITC的熒光強(qiáng)度在同一范圍內(nèi)強(qiáng)烈依賴于pH值。
| TF 染料 | Ex(nm) | Em(nm) | 可替代 |
| TF1 | 353 nm | 442 nm | AF350, AMCA, EDANS |
| TF2 | 498 nm | 520 nm | AF488; DL488, FITC, FAM, Cy2 |
| TF3 | 560 nm | 575 nm | AF546, AF555, Cy3, DL549, TAMRA |
| TF4 | 585 nm | 605 nm | AF594, DL594, Texas Red®, ROX |
| TF5 | 650 nm | 670 nm | AF633, AF647, DL633, DL649, Cy5 |
| TF6 | 685 nm | 700 nm | AF680, DL680, Cy5.5 |
| TF7 | 755 nm | 780 nm | AF750, DL750, Cy7 |
| TF8 | 785 nm | 800 nm | DL800, IRDye CW800 |
使用TF標(biāo)記的FRET底物檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活性
基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）參與細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，在細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、生殖組織重塑和修復(fù)中起重要作用。 百螢為大家篩選了以下基于TF的FRET底物，以檢測MMP活性。
| #Sub | 肽序列 | Ex | Em |
| 1 | TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(5-FAM)-Ala-Lys-NH2 | 492 nm | 514 nm |
| 2 | TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(TF2)-Ala-Lys-NH2 | 495 nm | 520 nm |
| 3 | TQ3-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF3)-Ala-Lys-NH2 | 560 nm | 575 nm |
| 4 | TQ4-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF4)-Ala-Lys-NH2 | 585 nm | 605 nm |
| 5 | TQ5-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT5)-Ala-Lys-NH2 | 650 nm | 670 nm |
| 6 | TQ6-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT6)-Ala-Lys-NH2 | 685 nm | 700 nm |
| 7 | TQ7-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF7)-Ala-Lys-NH2 | 755 nm | 780 nm |
| 8 | TQ8-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF8)-Ala-Lys-NH2 | 785 nm | 800 nm |
MMP活性的檢測（續(xù)）
圖1.以TF為基礎(chǔ)的MMP底物與MMP-1（50units/ml）在室溫下孵育15分鐘。所有基質(zhì)在5 uM的溫度下使用，使用Sub#2的反應(yīng)速度設(shè)定為100%。用上表中分別列出的激發(fā)波長和發(fā)射波長測量熒光強(qiáng)度。
用TF標(biāo)記酪蛋白底物檢測通用蛋白酶活性
對各種蛋白酶活性的檢測已成為許多生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)任務(wù)。TF染料標(biāo)記的酪蛋白綴合物被證明是廣泛的蛋白酶的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白被TF染料大量標(biāo)記，導(dǎo)致了熒光猝滅。蛋白酶催化水解減輕了它的淬滅效應(yīng)，產(chǎn)生熒光性很強(qiáng)的TF染料標(biāo)記的肽段。TF染料標(biāo)記肽熒光強(qiáng)度的增加與蛋白酶活性成正比。
| #Sub | 肽底物 | Ex/Em | 相對Kcat/Km |
| 1 | TF1-Casein (~6 Dyes/Casein) | 492/514 nm | 98% |
| 2 | TF2-Casein (~6 Dyes/Casein) | 495/520 nm | 92% |
| 3 | TF3-Casein (~6 Dyes/Casein) | 560/575 nm | 100% |
| 4 | TF4-Casein (~5 Dyes/Casein) | 585/605 nm | 73% |
| 5 | TF5-Casein (~5 Dyes/Casein) | 650/670 nm | 81% |
| 6 | TF6-Casein (~4 Dyes/Casein) | 685/700 nm | 76% |
| 7 | TF7-Casein (~4 Dyes/Casein) | 755/780 nm | 56% |
| 8 | TF8-Casein (~4 Dyes/Casein) | 785/800 nm | 43% |
圖2. #3底物胰蛋白酶的蛋白水解裂解圖。 在室溫下將3號底物與胰蛋白酶一起孵育。對照孔僅具有蛋白酶底物，而沒有胰蛋白酶。 使用FlexStation從時間0（添加胰蛋白酶時）開始檢測熒光信號。
