類(lèi)型		貨號(hào)	名稱(chēng)
染料法	EvaGreen染料	08-36-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix 5×qPCR 預(yù)混液
		08-24-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX) 5×qPCR預(yù)混液,ROX
		08-25-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (no ROX) 5×qPCR預(yù)混液,無(wú)ROX
		08-26-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) 5×qPCR預(yù)混液,Capillary
	SolisGreen染料	28-41-00001	SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (no ROX)  5×qPCR預(yù)混液,ROX
		28-46-00001	SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (ROX) 5×qPCR預(yù)混液,無(wú)ROX
	SYBR染料	QP031	qPCR預(yù)混液2.0,ROX
		QP041	qPCR預(yù)混液2.0,無(wú)ROX
探針?lè)?/strong>	08-17-00001		5×HOT FIREPol ® Probe Universal qPCR Mix
	QP036		5×探針qPCR預(yù)混液,ROX
	QP046		5×探針qPCR預(yù)混液,無(wú)ROX
	08-16-00001		5×HOT FIREPol® Probe qPCR Mix Plus (Capillary)
	多重qPCR	08-01-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix 5x多重探針qPCR預(yù)混液
		08-02-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Rox) 5x多重探針qPCR預(yù)混液,Rox
		08-03-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Purple) 5x多重探針qPCR 預(yù)混液,Purple
	快速qPCR	28-21-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (no ROX) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,無(wú)ROX
		28-22-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (ROX) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,ROX
		28-23-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (Purple) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,Purple
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    qPCR系統(tǒng)知識(shí)匯總

 

       在qPCR 技術(shù)中重要的參數(shù)指標(biāo)有哪些？

 

       擴(kuò)增及溶解曲線：擴(kuò)增曲線是PCR過(guò)程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動(dòng)態(tài)進(jìn)程；溶解曲線是用來(lái)驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會(huì)出現(xiàn)單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增，就會(huì)出現(xiàn)至少兩個(gè)峰。

 

       熒光域值（threshold）: 是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。

 

       Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值之間存在線性關(guān)系，可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

 

 

       擴(kuò)增曲線一般分為哪幾個(gè)階段

 

       熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。在qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化，此時(shí)即為基線期，

 

       PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期，在該時(shí)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系，只有在熒光信號(hào)的指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

 

 

       ROX染料是什么作用？

 

       ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應(yīng)中能被qPCR儀檢測(cè)到。ROX不參與qPCR反應(yīng)，熒光信號(hào)值不會(huì)隨著qPCR擴(kuò)增而改變。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中很多因素會(huì)引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學(xué)因素（液滴、氣泡）的因素，反應(yīng)體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽(yáng)性參比，對(duì)其他熒光信號(hào)進(jìn)行歸一化校正，以提高數(shù)據(jù)的精確度。

 

       Ct值多少才算理想

 

       一般來(lái)說(shuō)Ct值在30以下都可以說(shuō)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的，30以上基本可以說(shuō)明該基因沒(méi)有擴(kuò)增，但也不是絕對(duì)的，需要輔以溶解曲線加以解釋。

 

    *** qPCR 常見(jiàn)問(wèn)題分析 ***

 

問(wèn)題類(lèi)型	原因分析
無(wú)Ct值出現(xiàn)	* 檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時(shí)采集，探針?lè)▌t一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)； * 引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性； * 模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起； * 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況
Ct 值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38）	* 擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，設(shè)計(jì)更好的引物或探針、適當(dāng)降低退火溫度、增加鎂離子濃度等； * PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不足； * PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳	* 加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度； * 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品 * 引物或探針不佳：重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針； * 模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高
擴(kuò)增曲線異常，比如 S 型曲線	* 參比染料設(shè)定不正確：預(yù)混液不加參比染料時(shí)，選NONE； * 模板的濃度太高或者降解； * 熒光染料的降解
負(fù)對(duì)照有信號(hào)、溶解曲線不止一個(gè)主峰	* 引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn) * 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比 * 鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；
擴(kuò)增效率低	* 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解； * 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度； * 反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋?zhuān)�再加入反�?yīng)體系中，減少抑制物的影響

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       艾美捷科技有限公司，通過(guò)提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價(jià)值觀：“激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越”。激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競(jìng)爭(zhēng)力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造最大價(jià)值是我們的企業(yè)使命。我們的企業(yè)愿景是成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。

 

       作為一家具有尖端的技術(shù)實(shí)力、一流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷國(guó)家級(jí)高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國(guó)。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，為用戶提供最前沿的專(zhuān)業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶，公司組建了一支經(jīng)驗(yàn)豐富的研發(fā)團(tuán)隊(duì)-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!

 

       艾美捷科技與國(guó)內(nèi)外優(yōu)秀的生物試劑供應(yīng)商保持著密切的合作關(guān)系，目前已成為眾多國(guó)際知名品牌的中國(guó)總代理或一級(jí)代理，主要包括：AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、CytoNiChe、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、Matreya、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne等，可以在第一時(shí)間為用戶提供最前沿的專(zhuān)業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品及物流服務(wù)。

 

       三點(diǎn)：

       企業(yè)使命：激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競(jìng)爭(zhēng)力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造最大價(jià)值。

       企業(yè)愿景：成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。

       艾美捷定位：通過(guò)提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。

       六觀：

價(jià)值觀：激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越。