6月4日晚上七點(diǎn)，賽業(yè)生物云課堂開(kāi)始了主題為“神經(jīng)退行性疾病研究常用動(dòng)物模型及其應(yīng)用”的第四期課程，需要課件的老師可以關(guān)注“賽業(yè)生物訂閱號(hào)”，后臺(tái)留言“004”。針對(duì)答疑環(huán)節(jié)未及時(shí)解答的問(wèn)題，我們進(jìn)行了收集整理，下文為黃穎博士針對(duì)答疑環(huán)節(jié)提出的問(wèn)題給出的詳細(xì)解答。

 

Q：有些文獻(xiàn)的老鼠品系為SAMP8，不知道老師了解這個(gè)品系的老鼠嗎？它和APP/PS1比起來(lái)怎樣差別？

A：這個(gè)是全面衰老的模型，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)未出現(xiàn)之前，因?yàn)檫@個(gè)老鼠有一定的AD表型，主要是有老年斑，所以被當(dāng)成AD模型。但現(xiàn)在我們可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得產(chǎn)生老年斑且和AD關(guān)系更緊密的小鼠，或者可以直接注射合成的Aβ，這種小鼠的優(yōu)勢(shì)就沒(méi)有了。而且這種小鼠的壽命太短，無(wú)法做后期研究。所以目前總體來(lái)說(shuō)，用SAMP8小鼠研究AD，難以發(fā)高分文章。

 

Q：以AD為例，有些轉(zhuǎn)的人的APP，有轉(zhuǎn)的小鼠的，表型有區(qū)別嗎？以及轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)進(jìn)去的拷貝數(shù)對(duì)表型有多大影響？

A：1. 表型是有區(qū)別的。小鼠和人的Aβ有3個(gè)AA的差異，人的更容易聚集；小鼠的APP在被BACE1剪切的時(shí)候效率更高。這就造成了用小鼠的APP更容易被BACE1剪，對(duì)造模有利，但是產(chǎn)生的Aβ聚集的能力較差；而用人的APP，如果拷貝數(shù)不夠，可能在利用BACE1這一點(diǎn)上競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)小鼠的APP，但目前的AD轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)通過(guò)拷貝數(shù)的增加解決了這個(gè)問(wèn)題；另一方面現(xiàn)在的雙轉(zhuǎn)APP/PS1系列小鼠中人的PS1對(duì)hAPP剪切效率高，所以小鼠的APP就用的少了。

2. 至于拷貝數(shù)，對(duì)表型也有很大的影響，一方面轉(zhuǎn)基因這種隨機(jī)插入會(huì)有破壞原有基因的可能；另一方面拷貝數(shù)增加肯定會(huì)增加Aβ的含量，但也需要考慮插入基因在基因組中的位置，不同的位置表達(dá)活性會(huì)受到影響。

 

Q：黃博士您好，AD患者常常共患精神疾病，是否可以造出這種共患病模型呢？

A：AD小鼠在一定程度上會(huì)存在抑郁或者社交回避行為，但是嚴(yán)重程度不同。如果想要加重精神疾病的行為，一方面可以結(jié)合該精神疾病遺傳易感基因造模（基因編輯的方法，但精神疾病大多只是易感性），不過(guò)這種方法在時(shí)間、效果和花費(fèi)上都有一定風(fēng)險(xiǎn)，所以，一般還是對(duì)AD小鼠進(jìn)行電擊或者懸尾，限制活動(dòng)等方式建模，要根據(jù)您研究的精神疾病種類采用具體的方法。

 

Q：黃博士您好，我想問(wèn)下關(guān)于APP/PS1小鼠進(jìn)行新物體識(shí)別試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)？

A：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)：

1. 相對(duì)而言，NORT實(shí)驗(yàn)中的小鼠內(nèi)在探索動(dòng)機(jī)不如水迷宮或者其他饑餓驅(qū)動(dòng)的強(qiáng)。此外，AD是老年病，太小還沒(méi)發(fā)病，看不出和對(duì)照的區(qū)別，因此在小鼠年齡稍大一點(diǎn)做更容易在NORT中出現(xiàn)記憶衰退表型（不要早于6個(gè)月，別人文獻(xiàn)里做出來(lái)了，我們不見(jiàn)得能重復(fù)出來(lái)）；

2. 每換下一只小鼠前一定要擦干凈物體，箱子也要擦干凈，建議同樣的物體多準(zhǔn)備十幾套，這樣可以不用擦洗，每次直接用沒(méi)有上一只小鼠接觸的物體，不過(guò)這是理想情況，具體看你們實(shí)驗(yàn)室會(huì)不會(huì)支持你這么干。

3. 要充分考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定學(xué)習(xí)和記憶之間的間隔時(shí)間，一般短時(shí)記憶10分鐘-1小時(shí)，長(zhǎng)時(shí)記憶12小時(shí)-24小時(shí)。

4. 老鼠最好實(shí)驗(yàn)前1周就放到實(shí)驗(yàn)所在的房間飼養(yǎng)，總之有條件的話盡早適應(yīng)環(huán)境。

5. 每次一定要記錄好小鼠的狀態(tài)，因?yàn)锳D小鼠經(jīng)常有異常精神狀態(tài)的出現(xiàn)（特別是15個(gè)月之后），有異常的可以有理有據(jù)地剔除。

 

Q：有些文獻(xiàn)里面提出的C57-APP/PS1 里的老鼠表示啥意思�。�

A：C57是老鼠的品系，是一種近交系小鼠，APP和PS1是家族性AD中的突變基因，所以人們希望把突變了的這兩個(gè)基因在小鼠里過(guò)表達(dá)，以獲得AD的表型。

 

Q：我想問(wèn)下關(guān)于AD模型，比如說(shuō)其他藥物誘導(dǎo)的模型與轉(zhuǎn)基因鼠的優(yōu)缺點(diǎn)，比如說(shuō)脂多糖和d-gal？

A：藥物誘導(dǎo)快速，年齡限制較小；但其實(shí)目前AD的誘導(dǎo)方法都沒(méi)有構(gòu)成與人AD發(fā)病的因果關(guān)系。雖然Aβ假說(shuō)和tau假說(shuō)一直受到挑戰(zhàn)和藥物開(kāi)發(fā)的結(jié)果打臉，但這兩個(gè)基因的突變就是會(huì)產(chǎn)生人的AD，這個(gè)是確定的。不過(guò)基因編輯尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠的問(wèn)題也不少，過(guò)表達(dá)本身就是一種artificial，KI的表型又不明顯。但是總體而言，從科學(xué)的角度上看，在藥物誘導(dǎo)AD的機(jī)理不明確之前，基因編輯小鼠的模型更令人信服。

 

Q：黃博士您好，我們現(xiàn)在做一個(gè)實(shí)驗(yàn)。如果我們選用的實(shí)驗(yàn)鼠是APP/PS1，那么他選用的對(duì)照鼠最好是什么老鼠？

A：如果您不是專門(mén)研究APP或者是PS1的功能，只需要AD的病理特征的話，用同窩野生型就行了，目前轉(zhuǎn)基因小鼠只能這樣選對(duì)照。

 

Q：怎樣才算合格的模型，怎樣保證實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性呢？

A：以我最熟悉的AD小鼠為例，完全合格的模型需要：

1. 用人的PS1或者APP替代鼠源對(duì)應(yīng)基因

2. 全長(zhǎng)基因敲入（不是過(guò)表達(dá)哦）

3. 有一切病理表型

但其既然是模型，就每一點(diǎn)都要妥協(xié)。所以只能像盲人摸象一樣用有不同特性的模式動(dòng)物去模擬，最后拼湊出一個(gè)較為完整的疾病機(jī)理出來(lái)。所以只要能有一部分病理表現(xiàn)是穩(wěn)定的模型就是合格的模型。而基因編輯也是一樣，沒(méi)有條件的話也可以用與該疾病無(wú)關(guān)的突變，比如MAPT突變之于AD。遺憾的是，雖然我們常用的小鼠已經(jīng)是背景基因極為一致的近交系了，但每只小鼠的生活軌跡在同窩小鼠中的地位都是有一定區(qū)別的，比如有的小鼠怕人，有的小鼠就不怕，是無(wú)法保證實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性的，要不為什么同樣品系的AD小鼠，同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總是千差萬(wàn)別。我們只能保證每次實(shí)驗(yàn)中小鼠的分組和實(shí)驗(yàn)操作保持一致性。

 

Q：黃博士您好，我們正在進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)，一般選用哪個(gè)模型？

A：藥理實(shí)驗(yàn)我以前用的是APP/PS1DeltaE9，這是雙轉(zhuǎn)里用得最多的。如果你們僅僅想看Aβ通路的表型，TG2576，APP/PS1DeltaE9和5×FAD都可以，要看對(duì)tau的影響就需要3×TG。

 

Q：老師，既然單基因突變更符合人類假說(shuō)，那么多基因突變模型鼠更大的優(yōu)勢(shì)在哪里？

A：其實(shí)大部分單基因突變的效果不是很好，多轉(zhuǎn)基因小鼠有很多也是這樣，所以190多種動(dòng)物里常用的就10種，但多基因可以在機(jī)理上研究不同基因過(guò)表達(dá)后的一些生理病理變化，在疾病機(jī)理的研究方面是有價(jià)值的，比如人只要有AD，就會(huì)有tau的過(guò)磷酸化和胞內(nèi)聚合物，而人的tau突變則對(duì)應(yīng)的是FTD，而不是AD。但如果只針對(duì)APP和PS1建模，永遠(yuǎn)得不到tau的病理表型，所以要研究tau的上下游功能和疾病機(jī)理，就需要人為讓tau的基因發(fā)生突變，產(chǎn)生tau的病理現(xiàn)象。另一方面，多轉(zhuǎn)基因也是為了讓小鼠具有更快更明顯的病理表型�？偠�言之，多基因突變小鼠模型的表型更早、更明顯。

 

Q：除了基因法，能不能用化學(xué)法做轉(zhuǎn)基因AD鼠？

A：有是有，有人介紹過(guò)，不過(guò)我看論文的經(jīng)驗(yàn)是這20年出現(xiàn)很少了，畢竟最常用的基因編輯小鼠的表型很好了，需要信息的話請(qǐng)加我微信，我把那篇介紹的文章發(fā)給您。

 

Q：BACE失敗原因大概是什么呢？

A：可以引用在AD藥物研發(fā)中用了無(wú)數(shù)次的一句話來(lái)概括：當(dāng)一個(gè)煙頭引發(fā)了一場(chǎng)森林大火以后，再如何撲滅這個(gè)煙頭已經(jīng)沒(méi)有意義了。因?yàn)橛糜谂R床試驗(yàn)的病患都是已經(jīng)確診的AD患者，這時(shí)候他們的病情早已發(fā)展了十幾年，很多其他的蛋白信號(hào)通路都已改變，積重難返了。

 

Q：帕金森動(dòng)物模型有介紹嗎？

A：賽業(yè)生物神經(jīng)云課堂系列文章有介紹過(guò)，老師感興趣的話可以關(guān)注“賽業(yè)生物訂閱號(hào)”，點(diǎn)擊菜單賽業(yè)課堂—小鼠干貨—神經(jīng)科學(xué)，即可查看相關(guān)內(nèi)容。

 

術(shù)業(yè)有專攻，鑒于以下幾位老師的問(wèn)題我沒(méi)有深入了解過(guò)，因此就只簡(jiǎn)單地發(fā)表一下我了解的一些情況，如果老師有需要，可以后臺(tái)留言留下您的聯(lián)系方式，我咨詢做過(guò)這方面的老師幫您解答。

 

Q：還有一個(gè)問(wèn)題是，關(guān)于藥物治療pd模型，有的文章是聯(lián)合用藥，有的文章是先構(gòu)建模型再藥物治療，有的是聯(lián)合用藥后mptp停用，治療藥物繼續(xù)治療，請(qǐng)問(wèn)這幾種方法的區(qū)別以及他們能說(shuō)明的問(wèn)題？

A：抱歉，由于我沒(méi)做過(guò)PD，暫時(shí)無(wú)法解答這個(gè)問(wèn)題，但是我可以幫你問(wèn)問(wèn)做過(guò)這塊的老師，看文獻(xiàn)的時(shí)候也會(huì)留意這個(gè)問(wèn)題，老師可以先加我，我一有消息就聯(lián)系您。

 

Q: 我想問(wèn)下另外一種神經(jīng)退行性疾病CMT2A，而且很多knock in 的基因突變的神經(jīng)退行性疾病沒(méi)有表型的原因有哪些呢？是不是由于人鼠物種的差異？

A：我不太熟悉CMT2A，以下回答只是我個(gè)人的觀點(diǎn)，如有錯(cuò)誤，請(qǐng)多包涵。CMT2A是常染色體顯性遺傳病，KI的表型一般都比TG弱，畢竟TG大多是在強(qiáng)啟動(dòng)子下的多拷貝，而KI是單拷貝，而且一般都用本身啟動(dòng)子。至于人和鼠的差異要看具體基因的差別，以及這些差別是否決定了與蛋白剪切和結(jié)合相關(guān)。

 

Q：如果我們自己用Abeta多肽或東莨菪減等化合物來(lái)構(gòu)建腦損傷模型，這個(gè)做起來(lái)它們的個(gè)體差異怎么樣？

A：我沒(méi)做過(guò)這個(gè)藥物建模實(shí)驗(yàn)，但據(jù)我了解，體外注射的個(gè)體差異要大于基因編輯小鼠。

 

Q：基因突變表現(xiàn)在蛋白上的位點(diǎn)如何體現(xiàn)呢，能否與分子模擬對(duì)接等手段相結(jié)合呢？

A：沒(méi)太看懂問(wèn)題，一般基因編輯動(dòng)物的描述中都會(huì)有M123A這種字母+數(shù)字+字母的表示來(lái)指蛋白位點(diǎn)，分子模擬沒(méi)接觸過(guò)，所以不懂，抱歉。

 

溫馨提示

 

賽業(yè)生物云課堂針對(duì)冠狀病毒、人源化小鼠、細(xì)胞培養(yǎng)、神經(jīng)科學(xué)等主題開(kāi)展了一系列課程，錯(cuò)過(guò)直播的老師可以通過(guò)以下方式進(jìn)行回看：

 

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