在培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中，你是否遇到：

本應(yīng)貼壁的細(xì)胞，某次傳代后出現(xiàn)不貼壁了？

細(xì)胞養(yǎng)不起來(lái)，生長(zhǎng)速度緩慢，或突然停滯生長(zhǎng)？

細(xì)胞狀態(tài)不好，視野中總是存在較多死細(xì)胞？

 

想要知道如何才能把細(xì)胞養(yǎng)好，我們需要先明確培養(yǎng)細(xì)胞的3個(gè)關(guān)鍵要素：良好的細(xì)胞來(lái)源，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作，正確的培養(yǎng)體系。關(guān)于操作，其中存在許多人為不可控因素，我們后期會(huì)另辟專題討論，今天重點(diǎn)聊下如何正確選擇合適的培養(yǎng)體系。

 

細(xì)胞的培養(yǎng)體系一般指用于培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，它在培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中主要發(fā)揮4大功能：提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、提供物質(zhì)傳遞的介質(zhì)和指示細(xì)胞環(huán)境，同時(shí)也要保證培養(yǎng)基對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞不會(huì)造成毒害或污染。通常情況下，細(xì)胞完全培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子和血清所組成。

 

 

01 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

目前市面上可選擇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類很多，如常用的DMEM（高糖/低糖）、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的RPMI 1640等。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基可滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的需求，但在培養(yǎng)某些較為特殊的細(xì)胞如干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)的效果經(jīng)常不盡人意，這便需要對(duì)培養(yǎng)基的成分進(jìn)行個(gè)性化調(diào)整。

 

OriCell會(huì)通過(guò)平行試驗(yàn)，針對(duì)不同的細(xì)胞嘗試多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分析并增減各培養(yǎng)基的成分，甚至將不同種類培養(yǎng)基按不同比例進(jìn)行調(diào)和等多種方式，甄選出最適合細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

 

02 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子則主要為白細(xì)胞介素類、生長(zhǎng)因子類、腫瘤壞死因子等，發(fā)揮促進(jìn)增殖分化、調(diào)節(jié)免疫等作用。

 

03 胎牛血清

在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，血清是唯一不屬于人工合成的成分，同時(shí)也讓血清成分成為細(xì)胞培養(yǎng)體系中最大的不確定因素，因此，如何選擇合適的血清是細(xì)胞培養(yǎng)得好壞的決定性因素之一。根據(jù)采血時(shí)機(jī)的不同，牛血清可分為胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、新生牛血清和小牛血清，我們細(xì)胞培養(yǎng)中一般使用的是胎牛血清，也是最為“干凈”、營(yíng)養(yǎng)最為豐富的血清。

 

胎牛血清是在母牛懷孕3-8個(gè)月時(shí)，通過(guò)胎牛心臟穿刺采血獲得新鮮的胎牛全血，經(jīng)自然層析、離心后收集得到去除血細(xì)胞、纖維蛋白等成分的淡黃色透明上清液體，并在生產(chǎn)過(guò)程使用多級(jí)高置流膜過(guò)濾技術(shù)和三級(jí)0.1µm終端微濾方法處理而獲取的血清。相比于新生牛和小牛血清，胎牛血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有傷害的成分最少，因此對(duì)于一些較“脆弱”的細(xì)胞如干細(xì)胞、原代細(xì)胞，一定要使用優(yōu)質(zhì)的胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。

 

04 胎牛血清的功能

血清的成分十分復(fù)雜，既有協(xié)助物質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍�、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的激素和因子等，正因?yàn)檠�清這種天然成分的復(fù)雜性，使得血清在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮了多種功能：

✔ 提供維持細(xì)胞生長(zhǎng)的激素，促進(jìn)所培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)；

✔ 彌補(bǔ)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或含量很少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；

✔ 提供結(jié)合蛋白，促進(jìn)細(xì)胞識(shí)別和利用維生素、脂類和其他激素等；

✔ 某些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用；

✔ 促進(jìn)細(xì)胞貼壁，提供可促進(jìn)細(xì)胞鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)的因子；

✔ 起酸堿度緩沖液作用；

✔ 提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞消化時(shí)殘留的胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

 

05 胎牛血清的使用

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，胎牛血清的使用濃度一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。

 

血清對(duì)溫度比較敏感，不使用時(shí)必須保存在-20℃。解凍血清時(shí)要預(yù)防沉淀發(fā)生，不能直接將冷凍的血清放入37℃水浴或者溫箱中，因?yàn)檠�清在融化時(shí)，蛋白先融而冰塊后融，局部蛋白濃度過(guò)高易發(fā)生沉淀，影響血清質(zhì)量。

 

若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清，一般情況下不過(guò)濾也不會(huì)對(duì)效果造成影響。血清在解凍后，如果一次無(wú)法用完一瓶，可按 40～50mL分裝于無(wú)菌處理瓶中，再放入-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

 

06 胎牛血清使用不當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)

近年來(lái)全球疫情頻發(fā)，很多都是動(dòng)物來(lái)源的病毒傳播，我國(guó)對(duì)于動(dòng)物源制品的進(jìn)口一直有很嚴(yán)格的規(guī)定，而對(duì)于疫區(qū)來(lái)源的胎牛血清，同樣存在較大的生物學(xué)污染風(fēng)險(xiǎn)，比如病毒、支原體、噬菌體污染等。這對(duì)于使用血清進(jìn)行科研的實(shí)驗(yàn)操作人員造成了重大的潛在隱患，因此，國(guó)內(nèi)官方對(duì)此也有明確的公告：未經(jīng)檢疫的胎牛血清可能攜帶傳染性物質(zhì)，一旦流入境內(nèi)，將會(huì)對(duì)人民群眾的生命健康造成重大威脅，如可能帶有瘋牛病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、狂犬病毒或其他傳染性物質(zhì)，具有極高的檢疫風(fēng)險(xiǎn)。

 

此外，不合格的血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、穩(wěn)定性和真實(shí)性也會(huì)造成嚴(yán)重影響。

1）無(wú)合格質(zhì)檢的胎牛血清存在支原體、病毒等污染，這對(duì)涉及細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成不良影響；

2）采血工藝不規(guī)范導(dǎo)致溶血，溶血較嚴(yán)重的血清含有許多胞內(nèi)產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞有刺激作用，影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的真實(shí)性；

3）血清批次不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)。

 

07 如何選擇合適的胎牛血清

由于胎牛血清來(lái)源的特殊性，這使得選擇血清也成為了一門技術(shù)活。那么如何來(lái)甄別和選擇血清呢？

 

• 看產(chǎn)地

受供體飼養(yǎng)環(huán)境、生產(chǎn)工藝等因素的影響，原產(chǎn)澳洲、新西蘭的血清是目前品質(zhì)較高的血清來(lái)源。雖然北美洲的血清質(zhì)量也較高，但受疫情及國(guó)家進(jìn)口政策的限制，目前尚無(wú)正規(guī)渠道購(gòu)買北美的血清產(chǎn)品。

 

• 看外觀

1）顏色：根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，實(shí)際上，血紅蛋白含量的高低對(duì)血清質(zhì)量并無(wú)直接影響，這個(gè)指標(biāo)的意義在于能體現(xiàn)出采血過(guò)程的嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范程度。胎牛血清或多或少總有點(diǎn)溶血，因?yàn)檎嬲�的胎牛血清凝血功能差，紅細(xì)胞容易破裂。

2）澄清度：高質(zhì)量的胎牛血清由于蛋白和脂類等物質(zhì)含量低，表現(xiàn)為稀薄、清淡，而新生牛血清，相對(duì)而言更加粘稠，顏色略深。

3）血清沉淀：血清有沉淀，是質(zhì)量問(wèn)題？血清中的沉淀是由纖維蛋白的凝聚產(chǎn)生，對(duì)血清質(zhì)量沒(méi)有任何影響，沉淀的產(chǎn)生原因很多，跟加工生產(chǎn)方式、是否反復(fù)凍融密切相關(guān)。雖然沉淀并不直接影響血清的質(zhì)量，但對(duì)細(xì)胞的顯微觀察有一定的阻礙。

 

• 看批間差異

采購(gòu)血清要關(guān)注血清的批間差異。經(jīng)驗(yàn)豐富的供應(yīng)商會(huì)制定嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)，確保血清篩選標(biāo)準(zhǔn)的一致性，盡可能降低血清的批間差異，盡可能消除因采血、生產(chǎn)、貯藏工藝不同而造成的批間差異。

 

最后，適合自己細(xì)胞生長(zhǎng)的才是最好的。

 

08 胎牛血清有哪些重要的技術(shù)性指標(biāo)？

1）內(nèi)毒素：標(biāo)準(zhǔn)為不高于10EU/mL。內(nèi)毒素是細(xì)菌破碎后細(xì)胞壁的成分，因此內(nèi)毒素含量的高低可表現(xiàn)出采血到生產(chǎn)一系列過(guò)程中的無(wú)菌操作情況。

2）總蛋白含量：胎牛血清總蛋白含量一般范圍是30-50mg/mL，數(shù)值偏高，說(shuō)明采血的牛齡偏大，不是胎牛，數(shù)值偏低，表明血清可能摻水了。

3）血紅蛋白：標(biāo)準(zhǔn)為不高于30mg/dl，顏色越紅，數(shù)值越高。

4）pH：7.0~8.0。

5）微生物：包括細(xì)菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原性病毒等。

6）免疫球蛋白（IgG）：免疫球蛋白的數(shù)值能完全體現(xiàn)出采血時(shí)的牛齡情況，新生牛的血清中容易產(chǎn)生IgM，IgG的含量也偏高，進(jìn)口胎牛血清不含IgM，另外IgG的含量也較低。