副神經(jīng)節(jié)瘤（paraganglioma, PG）和嗜鉻細(xì)胞瘤（pheochromocytoma, PC）都是在自主神經(jīng)系統(tǒng)中嗜鉻細(xì)胞中發(fā)生的腫瘤。目前研究表明PG/PC遺傳因素占40%，其中琥珀酸脫氫酶亞單位SDHB造成的PC/PD的惡性程度是最高的，達(dá)到了38%-83%。然而目前對于惡性的PG/PC沒有有效的治療方法，并且，目前還沒有琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）突變的PC/PG完善模型。近期，有研究人員新研發(fā)了兩種基于SDHB突變自發(fā)PC/PG腫瘤的大鼠模型及相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系，為PC/PG腫瘤的研究提供更好的的動(dòng)物模型。

 

背景介紹

 

PG和 PC都是在自主神經(jīng)系統(tǒng)中嗜鉻細(xì)胞中發(fā)生的腫瘤。從這個(gè)定義來看，副神經(jīng)節(jié)瘤好像歸屬于嗜鉻細(xì)胞瘤一樣，但其實(shí)二者是并列關(guān)系，主要區(qū)別在于腫瘤起源的部位。嗜鉻細(xì)胞瘤被定義為起源于腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞腫瘤，而副神經(jīng)節(jié)瘤的起源則為腎上腺之外。PC多數(shù)情況下具有兒茶酚胺功能活性，而PG這種情況比較少見，由于都是自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生了腫瘤且有過量的兒茶酚胺（catecholamine）產(chǎn)生，因此這兩種腫瘤的癥狀常常是共通的，如頭痛、出汗、心率加快、焦慮、高血壓、顫抖、反胃和體重降低等。雖然總體而言此類腫瘤患病率不算很高，大約為1/300000左右，也并非胰腺癌一樣診斷即“死刑”的惡性腫瘤，但放任不管肯定會大大提高其轉(zhuǎn)移和惡性化的風(fēng)險(xiǎn)，此外其癥狀也會嚴(yán)重影響患者的生活，因此，對其研究和藥物開發(fā)也必須予以高度重視。

 

目前研究表明PG/PC遺傳因素占40%，并且和其他的腫瘤一樣，年齡的增長也會使其發(fā)病率提高。很多基因的突變會與PG/PC產(chǎn)生聯(lián)系，如琥珀酸脫氫酶（DH）亞基SDHB，SDHC 和SDHD ，它們的突變占據(jù)了家族性PG/PC的多數(shù), 其中SDHB更是其中的“頂梁柱”，除了上述SDH基因外, 其他與PG/PC相關(guān)的基因還有RET、SDHAF2、VHL、NF1、TMEM127、MAX和 SLC25A11等。

 

圖1. 副神經(jīng)節(jié)瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤[1]

 

SDHA、SDHB、SDHC和SDHD共同構(gòu)成線粒體內(nèi)膜呼吸鏈上的復(fù)合體2（Respiratory Complex II，RC2）。而RC2也是唯一一個(gè)同時(shí)兼職三羧酸循（Tricarboxylic Acid Cycle，TAC）環(huán)和電子傳遞鏈（Electron transport chain）的重要蛋白復(fù)合物。

 

這四個(gè)亞基中SDHA和SDHB位于基質(zhì)中，作為催化功能單位存在；而SDHC和SDHD則嵌入在線粒體內(nèi)膜中，負(fù)責(zé)錨定整個(gè)RC2。進(jìn)一步細(xì)分的話，SDHA將琥珀酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸（fumarate），同時(shí)FAD轉(zhuǎn)化成了FADH2；SDHB接受FADH2的電子，并將電子通過SDHC/SDHD傳遞給輔酶Q（ubiquinone），從而完成RC2的功能。哺乳動(dòng)物的琥珀酸脫氫酶除了能量代謝，氧化環(huán)境感知這種本職工作之外，也是重要的抑癌蛋白，它們功能失常會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。如前文所述，RC2四個(gè)亞基中的三個(gè)都與遺傳性PG/PC有著密切的關(guān)系。尤其是SDHB，其突變造成的PC/PD的惡性程度是最高的，達(dá)到了38%-83%，而SDHD突變造成的PG/PC基本為良性，散發(fā)性PG/PC惡性率也低于10%。

 

目前對于惡性的PG/PC沒有有效的治療方法，并且，目前還沒有SDH突變的PC/PG完善模型，基于這個(gè)原因，開發(fā)一種基于SDHB突變的自發(fā)PC/PG腫瘤動(dòng)物以及相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系將對該腫瘤的機(jī)理研究和藥物臨床前研發(fā)提供很大的幫助。

 

圖2. SDHB的功能[2]

 

對新構(gòu)建的SDHB雜合敲除大鼠進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證

 

與小鼠或其他物種相比，大鼠有很高的概率自發(fā)形成PC和PG（不過PC發(fā)生的概率比PG高）。在野生型SD大鼠中，最早12月齡就可以自發(fā)形成PC，到了24月齡時(shí)，PC的患病率可以達(dá)到10%，并且還可以人為通過高能量食物，輻照，藥物以及激素刺激等方法增加PC的發(fā)病率。因此，利用大鼠的這一特性開發(fā)SDHB相關(guān)的PG/PC腫瘤細(xì)胞模型會是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

 

研究人員委托賽業(yè)生物科技公司用TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技術(shù)構(gòu)建了4種SDHB堿基缺失情況不同的大鼠，結(jié)果有3種突變成功地遺傳繁育下來。對構(gòu)建好的SDHB缺失大鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄層面，Sdhb+/-大鼠肝臟的SDHB表達(dá)正好相當(dāng)于野生型的50%左右，而蛋白表達(dá)則為野生型的68%。而且Sdhb+/-線粒體復(fù)合體2的活性也只有野生型的一半了。上述結(jié)果說明將SDHB的表達(dá)和活性減弱的目的已經(jīng)達(dá)到。

 

將Sdhb+/-與Sdhb+/-進(jìn)行交配，可以看到有1/4的胚胎致死率（正好符合純合Sdhb-/-所占比例），所以用來后續(xù)構(gòu)建腫瘤模型的大鼠只能是雜合子。這說明SDHB對于動(dòng)物的存活是必須的。經(jīng)過多次嘗試，兩種能夠進(jìn)行無限連續(xù)移植的PC腫瘤的大鼠脫穎而出。它們都是經(jīng)過輻照的大鼠，分別命名為RS0和RS1/2。這兩種大鼠以及由其PC/PG腫瘤培養(yǎng)而來的腫瘤細(xì)胞系將成為后續(xù)研究的主角。

 

圖3. Sdhb+/-大鼠SDHB的表達(dá)及SDHB缺失造成的影響[3]

 

SDHB缺失造成的病理改變

 

如果僅僅是SDHB基因的表達(dá)和RC2復(fù)合體活性發(fā)生改變，還不能成為理想的模型。需要進(jìn)一步的組織形態(tài)驗(yàn)證。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RS0經(jīng)過HE染色后有明顯的Zellballen結(jié)構(gòu)（這種結(jié)構(gòu)是PC/PG腫瘤組織的重要特征），有著更清晰的血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，和人類PG的形態(tài)也非常相似。而RS1/2的細(xì)胞則更加彌散。在SDHB和SDHA的染色方面，可以看到RS0的SDHB表達(dá)顯著低于RS1/2，而SDHA二者都有較高的表達(dá)。酪氨酸羥化酶（TH）的染色則是RS1/2更為彌散�？傊甊S0在病理表型上展現(xiàn)出了多項(xiàng)PC/PG的特征。

 

不過這里卻留給人一個(gè)疑問，那就是為什么同是由SDHB雜合子發(fā)生了PC/PG的大鼠組織，RS0和RS1/2之間會有如此大的區(qū)別呢？尤其是理論上基因型一致的兩種大鼠，為什么SDHB的表達(dá)差異如此之大。不要急，待到后面講到全基因組測序（WGS）的時(shí)候會公布答案。

 

圖4. 大鼠異種移植PC/PG腫瘤病理結(jié)果展示[3]

 

大鼠PG/PC腫瘤細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

 

剛才觀察的是組織層面的表型，如果我們將視野用電鏡聚焦到細(xì)胞內(nèi)，那么可以看到RS0較于RS1/2神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒（secretory granules，箭頭所示）的分布更加彌散，細(xì)胞質(zhì)液泡更大更多（v），這與SDH缺陷的人腫瘤細(xì)胞非常類似。另一方面，RS0細(xì)胞也與以前的SDH缺陷導(dǎo)致的胃間質(zhì)瘤一樣出現(xiàn)了線粒體細(xì)長的現(xiàn)象。與組織層面的結(jié)果類似，因此相較于RS1/2，RS0在很多方面都與人的SDH缺陷腫瘤組織具有更為接近的表型。

 

圖5. 大鼠異種移植PC/PG腫瘤細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)展示[3-5]

 

可傳代PC/PG細(xì)胞系的獲得

 

表型有了，下一步就是要將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成能夠無限傳代方便保存的細(xì)胞系了。如果用常規(guī)RPMI培養(yǎng)液（Roswell Park Memorial Institute Medium）加入10%馬血清和5%胎牛血清，并將細(xì)胞置于5%氧氣培養(yǎng)箱中，RS0細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)會很快產(chǎn)生并聚集液泡進(jìn)而造成細(xì)胞在2周左右死亡；而RS1/2細(xì)胞在同樣的條件下則不會產(chǎn)生液泡，并可以存活數(shù)月，只不過細(xì)胞體積會隨著細(xì)胞接近死亡而緩慢減小。為了讓RS0細(xì)胞“升級”成細(xì)胞系，需要進(jìn)一步改變培養(yǎng)條件，通過降低血清濃度并降低培養(yǎng)箱含氧量，同時(shí)在培養(yǎng)液中加入促干細(xì)胞因子，經(jīng)過多次嘗試后，終于培養(yǎng)得到了RS0細(xì)胞系。在無血清條件下，RS0能夠脫壁懸浮生長并能聚集成細(xì)胞團(tuán)。通過BRDU（檢測DNA復(fù)制）染色（黑色）可以觀察到聚集成團(tuán)的細(xì)胞仍然處于不斷增生的狀態(tài)之中。至此，PC/PG細(xì)胞系宣告構(gòu)建成功，接下來要做的就是進(jìn)行分子水平的驗(yàn)證了。

 

圖6. 可傳代細(xì)胞系的表型[3]

 

腫瘤和細(xì)胞系的全基因組測序（WGS）

 

為了進(jìn)一步明確RS0和RS1/2細(xì)胞系在基因?qū)用姘l(fā)生了怎樣的改變，作者對兩種細(xì)胞系進(jìn)行了全基因組測序，并與其來源大鼠的正常組織進(jìn)行了對比。

通過將SDHB外顯子1及其上游一共1.4k左右的片段進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了RS0細(xì)胞系保留了因基因編輯造成的sdhb第1外顯子上的13個(gè)堿基缺失去，同時(shí)還有sdhb基因上游啟動(dòng)子前729bp的丟失，而且與RS0大鼠不同的是，RS0細(xì)胞系中的這兩處改變都是純合的，這可能是RS0腫瘤表型明顯的原因之一。另一方面RS1/2大鼠來源的腫瘤細(xì)胞系則發(fā)生了相反的改變，其13bp的缺失恢復(fù)成了野生型。

 

圖7. 全基因組測序分析[3]

 

代謝和蛋白表達(dá)炎癥

 

為了進(jìn)一步確定RS0和RS1/2兩種腫瘤的特征，需要繼續(xù)對RS0和RS1的代謝物進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種腫瘤細(xì)胞的琥珀酸鹽都發(fā)生了嚴(yán)重的積累（紅框）；乳糖（綠框）或谷氨酸（藍(lán)框）的積累也和SDH相關(guān)的人源腫瘤細(xì)胞的情況非常類似。如果想用RS0進(jìn)行PG研究，可以發(fā)現(xiàn)RS0具有SDH缺乏型PG的高多巴胺表達(dá)，極低的去甲腎上腺素和腎上腺素表達(dá)。因此在代謝方面RS0也對PC/PG進(jìn)行了很好的還原。

 

HIF2A（Hypoxia Inducible Factor 2 Alpha, EPAS1）的通路發(fā)生改變是SDHB突變的遺傳性癌癥的重要特征，于是在分子方面，作者也對這條信號通路相關(guān)RNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，RNASeq的結(jié)果表明HIF2A本身及其下游的Vegfa（Vascular endothelial growth factor A）表達(dá)都有10倍以上顯著升高。

 

使用PC12細(xì)胞（常用的神經(jīng)細(xì)胞株，SDHB正常）和大鼠甲狀腺髓質(zhì)細(xì)胞（Rat Adrenal Medullas, RAM）細(xì)胞作為對照，一次性比較腫瘤和細(xì)胞系之間基因表達(dá)的差異。如果對自發(fā)腫瘤進(jìn)行比較，相較于shdb+/-，sdhb-/-細(xì)胞HIF1A的表達(dá)提高，SDHB自身的表達(dá)降低。如果對各自細(xì)胞系與自發(fā)腫瘤進(jìn)行比較，在RS0自發(fā)腫瘤中SDHB高表達(dá)的情況下則可以發(fā)現(xiàn)RS0細(xì)胞系中SDHB的完全消失，這與WGS的結(jié)果一致，進(jìn)一步說明RS0細(xì)胞系與RS0自發(fā)腫瘤的差別。但有意思的是，RS1/2組織中的HIF2A的表達(dá)遠(yuǎn)低于RS0，這種情況在各自細(xì)胞系中則發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，RS1/2細(xì)胞系中HIF2A的表達(dá)顯著高于RS0中。至此，論文已經(jīng)部分完成了對新建大鼠SDHB相關(guān)PC/PG自發(fā)腫瘤和細(xì)胞系的構(gòu)建和驗(yàn)證。

 

圖8. 腫瘤移植物的代謝和表達(dá)驗(yàn)證[3]

 

總結(jié)

 

本研究主要有以下三點(diǎn)貢獻(xiàn)：

1. 開發(fā)了兩種基于SDHB突變的自發(fā)PC/PG大鼠可移植腫瘤

2. 開發(fā)了兩種具有不同PC/PG特征（SDHB缺陷和非SDHB缺陷）的腫瘤細(xì)胞系

3. 提供了低氧，低血清（或無血清）和干細(xì)胞誘導(dǎo)因子結(jié)合的腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建思路

 

作者同時(shí)為人們提供了可以遺傳的自發(fā)PC/PG大鼠用于活體腫瘤研究，也提供了便于操作的PC/PG細(xì)胞系，能為以后針對SDH突變的PC/PG研究提供了很大的便利。有意思的是，過往的SDHB抑制腫瘤模型和細(xì)胞系構(gòu)建的失敗一方面可能是由于太過“純凈”的SDHB敲除而缺乏由于輻照或其他未知原因引起的基因改變；另一方面也可能是過于執(zhí)著于用小鼠建模，而忽視了更易構(gòu)建PC/PG模型的大鼠。同時(shí)RS0和RS1/2兩種不同類型的PC/PG大鼠和細(xì)胞系也同時(shí)涵蓋了SDHB缺失和SDHB表達(dá)正常的兩種狀態(tài)，可以使后續(xù)的研究更加精細(xì)化，類似于PDX的大鼠自發(fā)腫瘤更適合用于臨床前藥物研究，而細(xì)胞系則可以在機(jī)理的研究中大顯身手。相信在不久的未來就能在嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤的研究過程中發(fā)現(xiàn)這些重要模型的身影。

 

參考文獻(xiàn)：

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2.https://en.wikipedia.org/

3.Powers JF,Cochran B,Baleja JD et, al. A xenograft and cell line model of SDH-deficient pheochromocytoma derived from Sdhb+/- rats[J]. Endocr Relat Cancer 2020

4.Powers J F , Brent C , Baleja J D , et al. A unique model for SDH-deficient GIST: an endocrine-related cancer[J]. Endocrine Related Cancer, 2018:ERC-18-0115-.

5.Szarek E , Ball E R , Imperiale A , et al. Carney triad, SDH-deficient tumors, and Sdhb+/- mice share abnormal mitochondria[J]. Endocrine Related Cancer, 2015, 22(3):345-352.