干細(xì)胞培養(yǎng)方法
 

       當(dāng)前干細(xì)胞最主要的培養(yǎng)方法仍是2D培養(yǎng)，2D培養(yǎng)僅在一個平面上支持干細(xì)胞生長，無法再現(xiàn)生物體內(nèi)細(xì)胞真實(shí)的3D立體微環(huán)境。2D培養(yǎng)環(huán)境在生物活性、培養(yǎng)基結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)物質(zhì)的釋放等很多方面均遠(yuǎn)不及3D培養(yǎng)，使干細(xì)胞逐漸喪失其原有的性狀、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致其研究結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)常不一致，精確性較低，所提供的培養(yǎng)環(huán)境與生物體內(nèi)微環(huán)境差距甚大，必然對干細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生負(fù)面作用。同時，2D培養(yǎng)增殖效率低，已經(jīng)無法滿足臨床干細(xì)胞大劑量應(yīng)用的需求。正是由于2D培養(yǎng)局限性太多，促使國內(nèi)外學(xué)者對3D培養(yǎng)技術(shù)和3D培養(yǎng)體系進(jìn)行深入探索。
 

 

     （A）在2D培養(yǎng)中生長的從上面(頂部面板)觀察圖像，細(xì)胞表面保持正常形態(tài); (B)在3D培養(yǎng)中生長的從上面(頂部面板)觀察圖像，細(xì)胞表面保持正常形態(tài); (C)在2D培養(yǎng)中生長的從側(cè)面(底部面板)觀察圖像，細(xì)胞厚度嚴(yán)重收縮; (D)在3D培養(yǎng)中生長的從側(cè)面(底部面板)觀察圖像，細(xì)胞厚度仍保持正常體內(nèi)形態(tài)。

       3D干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

       體外細(xì)胞培養(yǎng)的一個重要原則是需模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維單層細(xì)胞培養(yǎng)，三維干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensional cell culture，TDCC，簡稱3D培養(yǎng))是指通過細(xì)胞聚集建立細(xì)胞球或?qū)⒓?xì)胞嵌入支架上或支架內(nèi)來模擬真實(shí)生物體組織的ECM（細(xì)胞外基質(zhì)），進(jìn)而在一定程度上模擬體內(nèi)微環(huán)境。3D培養(yǎng)技術(shù)既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。

       那么，你知道目前都有哪些3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)嗎？一起來看一下吧！3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)很多，但總結(jié)起來主要可分為3類：

        1.3D水凝膠

       水凝膠是水膨脹性的高分子網(wǎng)絡(luò)，被設(shè)計用來模擬復(fù)雜的細(xì)胞外微環(huán)境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長因子組成。用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取的ECM聚合物。

       舉例：ECM凝膠

       從小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營養(yǎng)，與細(xì)胞的發(fā)育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40°C熱激活，凝膠化過程也是可逆的(蛋白質(zhì)濃度:8–12mg/ml)。

        ECM凝膠
 
       在BME中培養(yǎng)16天后，對MCF-10A細(xì)胞進(jìn)行染色：A）細(xì)胞染色試劑盒（結(jié)構(gòu)）；B）細(xì)胞核；C）線粒體膜電位； BME中培養(yǎng)12天后，對PC-3細(xì)胞進(jìn)行染色：D）Calcein AM（細(xì)胞活力）；E）CPA染料1（細(xì)胞核）；F）線粒體膜電位

        2.細(xì)胞聚集

       基于細(xì)胞聚集的方法不需要額外添加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，細(xì)胞會產(chǎn)生內(nèi)源的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細(xì)胞數(shù)量、孵育時間和細(xì)胞增殖率等因素。

       舉例：懸滴培養(yǎng)板

       3D懸滴培養(yǎng)平板的孔板經(jīng)過特殊設(shè)計，當(dāng)在小孔上方加入一滴細(xì)胞懸液時，孔板的幾何構(gòu)造就會引導(dǎo)細(xì)胞和培養(yǎng)基通過一個小洞，進(jìn)而形成一個穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個培養(yǎng)孔的上方，可用來更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長因子、小分子，也可用來加入細(xì)胞形成混合培養(yǎng)物。

       3.培養(yǎng)支架

       基本原理：支架可提供一種物理支撐，細(xì)胞可以進(jìn)入支架生長和行使功能�？紫斗植肌⒈┞镀矫鎱^(qū)域和孔隙度具有關(guān)鍵作用，其數(shù)量和分布會影響細(xì)胞滲透入支架的效率，而依據(jù)不同的制作工藝，支架具有不同的結(jié)構(gòu)、隨機(jī)或定制的孔隙分布。

       上述三類技術(shù)可根據(jù)產(chǎn)品是否為細(xì)胞提供支撐材料，3D干細(xì)胞培養(yǎng)體系大體可分為有材料支撐培養(yǎng)和無材料支撐培養(yǎng)（通過細(xì)胞聚集形成細(xì)胞球體）兩種類型。由于球體結(jié)構(gòu)存在難以控制以及與天然組織的差異等缺陷，因而限制了其作為3D培養(yǎng)模型的應(yīng)用，而3D有材料體系因?yàn)槟軌蚰�擬活體組織復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)而受到研究者青睞，成為當(dāng)前3D干細(xì)胞主流培養(yǎng)體系。 

       3D干細(xì)胞培養(yǎng)材料

       3D干細(xì)胞培養(yǎng)材料中適宜的空隙結(jié)構(gòu)、表面活性、機(jī)械強(qiáng)度及生物相容性，使干細(xì)胞能更好地在3D材料上黏附、增殖、分化，建立材料內(nèi)部各組分與干細(xì)胞間的緊密聯(lián)系及動態(tài)相互作用，形成一定的3D結(jié)構(gòu)。

      目前，常用的培養(yǎng)材料有天然材料（如膠原、透明質(zhì)酸、纖維蛋白、殼聚糖）、合成材料（如聚乳酸、聚己酸內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸、聚乙烯對苯二甲酸酯）以及新型復(fù)合材料（包括兩大類：天然材料相互復(fù)合、天然材料與合成材料復(fù)合，是如今3D干細(xì)胞培養(yǎng)研究的熱門）。

       材料的主要作用是為細(xì)胞提供原始支撐，同時也作為可溶性因子的擴(kuò)散媒介，保證干細(xì)胞與材料更好黏附、遷移、增殖、分化以及細(xì)胞的長期生長。

       3D干細(xì)胞培養(yǎng)材料需要具備的特點(diǎn)：

       (1) 三維多孔結(jié)構(gòu)  適宜的空間結(jié)構(gòu)和孔隙率，有利于干細(xì)胞的黏附、生長增殖。

       (2) 較好的生物相容性  材料對干細(xì)胞無毒性作用，可以和干細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合，且干細(xì)胞在生物體內(nèi)不會誘發(fā)排斥或炎癥反應(yīng)等。

       (3) 具備生物可降解性  有些材料可在生物體內(nèi)自行降解，降解速率應(yīng)保持在一個適宜范圍內(nèi)，過慢會蓄積體內(nèi)影響組織生長，過快則無法起到支持干細(xì)胞生長的效應(yīng)。

       (4) 良好的表面活性  有利于干細(xì)胞與材料結(jié)合，可附帶更多的生長因子，對其表達(dá)和釋放也具有較好的促進(jìn)作用。

       (5) 良好的成型能力和合適的力學(xué)強(qiáng)度  良好的力學(xué)強(qiáng)度是其能夠維持細(xì)胞生長空間的先決條件。

       符合上述所有條件的全新一代的3D FloTrix™ 干細(xì)胞微載體應(yīng)運(yùn)而生了：
 

 
       3D FloTrix™ 干細(xì)胞微載體

       3D FloTrix™ 干細(xì)胞微載體為全球?qū)＠�產(chǎn)品，由數(shù)萬顆彈性三維多孔微載體組成， 孔隙率>90%，粒徑大小可控于50-500μm區(qū)間， 均一度≤100μm，且生化、物理性質(zhì)可定制，形成真正的3D仿生培養(yǎng)。

       我們來看看實(shí)物吧：
 

       3D FloTrix™ 干細(xì)胞微載體：

       優(yōu)勢：
 

 

       3D FloTrix™ 干細(xì)胞微載體與市面上其他常見微載體比較：
 

 
       3D FloTrix™ 干細(xì)胞微載體特點(diǎn)及優(yōu)勢總結(jié)：

        1.一步法快速接種
        2. 原位傳代，免消化
        3.連續(xù)擴(kuò)增，避免污染
        4.原位凍存微組織，保持活性及三維結(jié)構(gòu)
        5.已獲得一級醫(yī)療器械資質(zhì)（目前唯一獲批醫(yī)療器械資質(zhì)的載體）
        6.藥用級別原料：藥典有收錄，確保使用安全性（目前市面上唯一藥用級別原料載體）
        7. 彈性微孔結(jié)構(gòu) ：耐受剪切力，保護(hù)細(xì)胞不受損傷
        8.有效表面積大 ：9000cm2/克，約可承載108-109細(xì)胞
        9.無菌片劑包裝：便于定量，無需滅菌溶脹，遇水即散
       10.可調(diào)控可定制：可為不同細(xì)胞定制適合微環(huán)境

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        六觀
        價值觀：激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越。