前文將肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（漸凍癥, ALS）的癥狀和治療手段做了一個(gè)小小的總結(jié)（戳這里可查看），今天我們來(lái)聊一聊ALS的機(jī)理及相關(guān)的動(dòng)物模型。在說(shuō)機(jī)理之前，一個(gè)繞不開(kāi)的話題就是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，因?yàn)樵摷膊≡斐傻膿p傷都是針對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的，雖然肌肉也受到了影響，但只能算得上是“次生災(zāi)害”。

 

 

漸凍癥與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)

 

主動(dòng)運(yùn)動(dòng)（Voluntary Movement）的信號(hào)傳遞始于大腦中的運(yùn)動(dòng)皮層和腦干(Brainstem)，運(yùn)動(dòng)皮層負(fù)責(zé)制定運(yùn)動(dòng)計(jì)劃，并為動(dòng)作發(fā)號(hào)施令；而腦干則負(fù)責(zé)一些更基礎(chǔ)的運(yùn)動(dòng)功能，如呼吸，運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)的維持等，很多時(shí)候不需要主動(dòng)意識(shí)的參與；在大腦里還有兩個(gè)輔助部門，基底神經(jīng)節(jié)（Basal Ganglia）和小腦（Cerebellum），基底神經(jīng)節(jié)負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)指令的準(zhǔn)備和糾正一些在命令傳遞過(guò)程中的錯(cuò)誤；小腦在運(yùn)動(dòng)的全過(guò)程中行使協(xié)調(diào)各部門職能的責(zé)任。皮層和腦干的命令發(fā)出以后，傳遞到了“地方官員”脊髓或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)池（Motor Neuron pools）中，注意這里有的信息是直達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)節(jié)，有的則是通過(guò)脊髓神經(jīng)傳達(dá)給運(yùn)動(dòng)神經(jīng)池；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)池中的各個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元就開(kāi)始給肌肉下達(dá)干活（運(yùn)動(dòng)）的指令。同時(shí)脊髓也會(huì)通過(guò)各種感覺(jué)神經(jīng)元將運(yùn)動(dòng)的結(jié)果匯總分析，如果分析出簡(jiǎn)單問(wèn)題則自行處理，復(fù)雜問(wèn)題則上報(bào)“中央（運(yùn)動(dòng)皮層或腦干）”等待指示。在正常的機(jī)體中，這一套行政體系可以有條不紊的進(jìn)行。ASL的病變就是發(fā)生在由上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（Upper Motor Neuron, UMN）和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（Lower Motor Neuron, LMN）所構(gòu)成的運(yùn)動(dòng)命令信息傳遞鏈上。UMN指的是不與肌肉直接聯(lián)系的皮層，腦干和脊髓中的神經(jīng)元（不包括小腦和基底神經(jīng)節(jié)這種輔助性腦區(qū)的神經(jīng)元）；而LMN則指的是與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)連接的基層干部。在ALS中作為底層的肌肉不會(huì)發(fā)生病變，只不過(guò)隨著神經(jīng)活動(dòng)的減弱而萎縮。

 

圖1. ALS和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)[1-2]

 

ALS的相關(guān)基因

 

每個(gè)病患的ALS的病程和癥狀差異很大，相關(guān)致病因素也是五花八門，相繼有報(bào)道稱腦外傷、高血壓、吸煙等因素與ASL有關(guān)，但目前公認(rèn)與ALS關(guān)系最密切的還是年齡和遺傳。年齡自不用說(shuō)，是很多神經(jīng)退行性疾病的最高風(fēng)險(xiǎn)。遺傳性因素也不惶多讓，雖然遺傳性的ALS占比不高，但仍然有20多個(gè)基因被列入了ALS的元兇名單。接下來(lái)我們就挑幾個(gè)重點(diǎn)的來(lái)詳述。

 

首先登場(chǎng)的是最早發(fā)現(xiàn)的超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1），1993年發(fā)現(xiàn)該蛋白的突變與ALS扯上了關(guān)系，雖然現(xiàn)在看來(lái)它對(duì)ALS的影響不是最大的（大概有20%的遺傳性ALS與之相關(guān)），但第一的身份讓它萬(wàn)眾矚目。SOD1的工作本來(lái)是將細(xì)胞產(chǎn)生的具有活性的過(guò)氧化物（該物質(zhì)的氧原子上還有額外的電子）轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫和氧氣。而突變了的SOD1不能完成這個(gè)任務(wù)，造成神經(jīng)元的氧化損傷，因此出現(xiàn)病癥；不過(guò)也有說(shuō)法是突變的SOD1本身也會(huì)聚集形成內(nèi)涵體，這就有點(diǎn)像PD中的α-synuclein了，但是在ALS中最重要的蛋白聚集并不是SOD1，而是“另有其人”。由于發(fā)現(xiàn)得早，做SOD1研究的人多，大家又陸陸續(xù)續(xù)地把其致病機(jī)理扯到了影響軸突運(yùn)輸，影響脊髓毛細(xì)管出血，誘發(fā)炎癥，破壞髓鞘等方面。

 

接下來(lái)，2001年發(fā)現(xiàn)了早發(fā)型ALS相關(guān)的ALS2，該基因編碼的蛋白負(fù)責(zé)核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)；2002年發(fā)現(xiàn)了參與RNA加工的SETX；2004年發(fā)現(xiàn)了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的VAPB；2006年ANG和CHMP2B加入了ALS致病基因家族，前者參與RNA加工，后者與核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬相關(guān)。

 

到了2008年，另一個(gè)大魔王浮出水面，這就是和AD中的tau，PD中的α-syn，HD（亨廷頓�。┲械膆tt并稱“四大惡人”的TDP-43，編碼這個(gè)蛋白的基因叫做TARDBP，中文全名是反式反應(yīng)DNA結(jié)合蛋白4（transactive response DNA-binding protein 4），雖然該基因的突變也就在不到5%的家族性和不到1%的散發(fā)性ASL中出現(xiàn)，看似不過(guò)“泯然眾基因”而已，不過(guò)在高達(dá)97%的病患的運(yùn)動(dòng)皮層和脊髓中都發(fā)現(xiàn)了TDP-43的內(nèi)涵體（出現(xiàn)TDP-43內(nèi)涵體可以不需要這個(gè)基因本身的突變，和AD中的tau何其相似�。。�，讓其搖身一變，炙手可熱。TDP-43平時(shí)主要參與和mRNA相關(guān)的工作，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，mRNA的剪切加工，轉(zhuǎn)運(yùn)或者代謝什么的。但在ALS的研究中，人們發(fā)現(xiàn)本應(yīng)該在細(xì)胞核內(nèi)工作的TDP-43大量涌入了細(xì)胞質(zhì)，從而導(dǎo)致了細(xì)胞核內(nèi)“勞動(dòng)力”不足，TDP-43負(fù)責(zé)的mRNA無(wú)法加工成成品，同時(shí)聚集在細(xì)胞質(zhì)中的TDP-43開(kāi)始躁動(dòng)，形成包涵體，危害神經(jīng)元的存活。

 

圖2. TDP-43沉積和ALS的相關(guān)基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[4]

 

2009年，對(duì)于ALS的遺傳研究來(lái)說(shuō)又是一個(gè)豐收的年份，除了發(fā)現(xiàn)另一個(gè)核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白FIG4以外，還發(fā)現(xiàn)了FUS（Fused in sarcoma）蛋白。FUS是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，它的突變?cè)诩易逍訟LS和散發(fā)性ALS中的貢獻(xiàn)分別是4%和1%。針對(duì)這個(gè)蛋白最開(kāi)始的研究是在脂肪肉瘤領(lǐng)域（liposarcoma），可以說(shuō)它本來(lái)的功能和TDP-43有一定程度的類似，它們的突變都能促使各自蛋白發(fā)生聚集，從而殺死神經(jīng)元。

 

再往后，SPG11（胞內(nèi)轉(zhuǎn)移酶，與軸突生長(zhǎng)相關(guān)），OPTN（自噬相關(guān)），ATXN2（RNA加工），VCP（自噬），SIGMAR1（蛋白酶系統(tǒng)，自噬）和UBQLN2（泛素蛋白酶系統(tǒng)，自噬）等相繼被揪出。其中UBQLN2（2011年發(fā)現(xiàn)）這個(gè)蛋白是位于X染色體上的，也是目前發(fā)現(xiàn)的所有有關(guān)ALS基因中唯一一個(gè)位于性染色體上的，雖然其突變只在ALS人群中占2.1%，但是否可以成為闡明ALS發(fā)病的男女差異的突破口呢？

 

但是，2011年ALS真正的主角不是UBQLN2，而是C9ORF72，不得不說(shuō)，起這個(gè)名字的人真是太懶了，C9指的是9號(hào)染色體，ORF72指的是第72個(gè)開(kāi)放閱讀框。ALS病人中這個(gè)C9ORF72片段中的內(nèi)含子部分中，有一個(gè)GGGGCC序列會(huì)發(fā)生400-2000次的重復(fù)，而在大部分非ALS患者中這個(gè)片段的重復(fù)在10次以內(nèi)。這種大量重復(fù)在家族性ALS中占比36.7%，散發(fā)性ALS占比為6.3%。另外值得注意的是，C9ORF72的這種改變?cè)诩易逍缘腇TD（額顳頁(yè)癡呆，以后講癡呆的時(shí)候會(huì)詳細(xì)介紹）中也是常客（25%）。所以在遺傳性的ALS中會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)FTD的身影。如果是在延髓性的ALS中，C9ORF72相關(guān)的病患比例會(huì)進(jìn)一步提高（44%）。從對(duì)這個(gè)基因的命名就可以看出，目前C9ORF72的功能還并不是十分確定，只有少數(shù)報(bào)道說(shuō)它參與自噬和內(nèi)涵體運(yùn)輸。有意思的是，該基因發(fā)生改變的ALS病患大多是在歐美，而在亞洲絕大部分地區(qū)是相當(dāng)罕見(jiàn)的。

 

接下來(lái)的時(shí)間里，雖然也陸陸續(xù)續(xù)發(fā)現(xiàn)了接近10個(gè)與ALS相關(guān)的基因，但還沒(méi)有出現(xiàn)C9ORF72同樣量級(jí)的ALS基因。所有的基因詳情和比較見(jiàn)圖3，圖中為最熱點(diǎn)的ALS基因標(biāo)上了顏色，沒(méi)有標(biāo)顏色的并不代表不重要，只是目前研究相對(duì)較少而已。

 

圖3. ALS的相關(guān)基因信息列表[4]

 

ALS小鼠模型

 

ALS不像PD一樣有較好的化學(xué)誘導(dǎo)模型，目前最靠譜的模型只能靠基因編輯，因此很多ALS轉(zhuǎn)基因小鼠也應(yīng)運(yùn)而生。如圖3所示，絕大部分ALS相關(guān)基因都是常染色體顯性的，因此要讓轉(zhuǎn)基因編輯小鼠出現(xiàn)癥狀并不是難事。如前文所述，SOD1因?yàn)橄劝l(fā)優(yōu)勢(shì)，針對(duì)其開(kāi)發(fā)的ALS模式小鼠非常之多，截止至2019年年中，已經(jīng)有接近30種之多；TARDBP（編碼TDP-43）相關(guān)也有超過(guò)30種；FUS有大概接近10種；其余的如UBQLN2，VCP和VABP的動(dòng)物模型則比較少。

 

另外有人可能要問(wèn)C9ORF72呢？這個(gè)當(dāng)然是有的，不過(guò)由于這個(gè)基因的外顯子突變是極少的，致病原因是內(nèi)含子中的片段重復(fù)，所以一般是通過(guò)BAC敲入或者是病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建（也有敲除的）。因此，雖然其發(fā)現(xiàn)較晚，但因?yàn)槠渑cALS相關(guān)性目前最高，對(duì)它的研究很多。綜合目前的多種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)家們提出了三種關(guān)于C9ORF72的假說(shuō)，其一是過(guò)度重復(fù)的片段造成該蛋白功能的缺失，其二是這些重復(fù)所轉(zhuǎn)錄的正義和反義RNA產(chǎn)生的毒性，其三就是這六個(gè)堿基編碼的二肽重復(fù)蛋白產(chǎn)生的毒性。

 

就動(dòng)物模型的構(gòu)建方式而言，過(guò)表達(dá)ALS相關(guān)基因所造成的神經(jīng)元死亡和運(yùn)動(dòng)障礙更加明顯，可以用來(lái)模擬患者中晚期的病情（圖4中綠色箭頭代表），而敲入（Knock in）相關(guān)基因?qū)π∈笏�造成的影響較小，一般被認(rèn)為可以模擬早中期的病情。

 

雖然與ALS相關(guān)的突變基本沒(méi)有“失活（Loss Function）”型的，但基因敲除小鼠仍然是我們研究這些基因功能和ALS深層機(jī)理的重要工具。在這些基因中TDP-43純合敲除小鼠是不可以繁衍的，其雜合子表現(xiàn)出一定的對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用。而SOD1基因敲除小鼠卻出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的外周神經(jīng)疾病，這與SOD1的抗氧化功能是吻合的。

 

一些點(diǎn)突變小鼠依然可以表現(xiàn)出很好的ALS病理特征。如VCPR155H在老齡時(shí)有50%的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，同時(shí)也能產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的TDP-43包涵體；不過(guò)行為癥狀上這些模型仍然有缺憾，該小鼠運(yùn)動(dòng)能力的減弱較輕微。

 

人源化小鼠模型隨著近幾年基因編輯技術(shù)的發(fā)展而成為熱點(diǎn)，這種方法在將小鼠原有基因的位置上替換上人類的對(duì)應(yīng)基因。人源化FUSδ14小鼠，會(huì)讓小鼠細(xì)胞中的FUS定位發(fā)生紊亂，從而造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。

 

如果對(duì)ALS相關(guān)模型小鼠感興趣，可以參考2019年Giorgio發(fā)表的一篇綜述[5]，里面匯總了上百種ALS小鼠的表型和病理特征，算是小編目前看到最全的了。如果您需要ALS相關(guān)的小鼠模型，賽業(yè)生物一站式服務(wù)平臺(tái)可以為您提供！

圖4. ALS小鼠模型的應(yīng)用[5]

 

關(guān)于ALS的介紹就到這了，后續(xù)我們的內(nèi)容將是關(guān)于多發(fā)性硬化這種神經(jīng)免疫疾病的，敬請(qǐng)關(guān)注。

 

往期回顧

1. 賽業(yè)生物第一期：無(wú)藥可救的神經(jīng)退行性疾病

2. 賽業(yè)神經(jīng)科學(xué)第二期：帶你了解發(fā)病率第二的神經(jīng)退行性疾病—帕金森綜合癥

3. 賽業(yè)神經(jīng)科學(xué)第三期：尋找造成帕金森病的兇手，重現(xiàn)案發(fā)過(guò)程

4. 賽業(yè)神經(jīng)科學(xué)第四期：冰桶挑戰(zhàn)背后的神經(jīng)退行性疾病——漸凍癥

 

參考文獻(xiàn)及引用圖片來(lái)源：

1. Dale Purves et al. Neuroscience. Sinauer Associates. 2018. 9781605353807,1605353809

2. https://en.wikipedia.org/

3. Al-Chalabi A , Hardiman O , Kiernan M C , et al. Amyotrophic lateral sclerosis: moving towards a new classification system[J]. Lancet Neurology, 2016, 15(11):1182-1194.

4. Al Sultan A, Waller R, Heath P, Kirby J. The genetics of amyotrophic lateral sclerosis: current insights. Degener Neurol Neuromuscul Dis. 2016;6:49-64

5. Giorgio F D , Maduro C , Fisher E M C , et al. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Disease Models & Mechanisms, 2019, 12(1):dmm037424.