《鼠年說鼠》系列文章，每周二更新，專門解答大小鼠鏟屎官們在養(yǎng)鼠過程中經(jīng)常遇到的繁育與鑒定類的問題，同時(shí)向大家征集問題，任何基因編輯鼠飼養(yǎng)繁殖或鑒定的困惑統(tǒng)統(tǒng)可以丟給小賽，小賽會給您回復(fù)或統(tǒng)一在后面的內(nèi)容為大家做出詳細(xì)的解答。今天我們開始進(jìn)入鑒定篇～

 

 

鑒定基因編輯鼠剪爪、剪尾組織量是多少？

根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，剪爪、剪尾應(yīng)在出生后 7—12 天內(nèi)完成，這樣一方面既可避免母鼠吃仔，另一方面該時(shí)段的大小鼠容易抓取、出血較少，提取的基因組質(zhì)量較高。

1.鼠尾尾尖（<5mm）可獲得足夠量DNA用于基因型鑒定。

2.AAALAC要求斷趾法，最好用于小于7日齡的新生鼠，斷趾操作剪取的鼠爪量為鼠爪趾尖組織1-2mm。

 

如何提取組織DNA模板？

 

方法一:

使用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit (Ver.5.0_Code No. 9765) 來提取鼠尾基因組DNA。

 

準(zhǔn)備工作：

1.備好無水乙醇。

2.WB使用前需要加入65mL的無水乙醇（試劑盒推薦56mL，我們經(jīng)過長期數(shù)據(jù)顯示，加入65mL提取的基因組純度更高）。

3.Buffer GL若出現(xiàn)沉淀，請于56℃加熱溶解，待恢復(fù)至室溫后使用。

4.洗脫膜上的DNA時(shí)，用0.25X TE buffer洗脫的DNA保存時(shí)間更持久；使用前放置56℃預(yù)熱，DNA洗脫效率更高。

 

實(shí)驗(yàn)流程：

1.每個(gè)裝有樣品的EP管中加 180μL Buffer GL, 20μL 蛋白酶K（用試劑盒里的蛋白酶K加20μL 即可，該濃度是20mg/mL），10μL RNA酶。（注意：鼠尾不能太長，一般2~5mm；如果鼠尾實(shí)在過粗，可以增大裂解體系至300μL）。

2.放置56℃ 烘箱過夜反應(yīng)（一般12~16個(gè)小時(shí)）。

3.第二天早上從烘箱取出樣品放置離心機(jī)里，12000rpm離心2分鐘，將毛發(fā)雜質(zhì)離到管底。

4.吸取上清至另一干凈的EP管中（注意盡量不要吸到管底的毛發(fā)和雜質(zhì)），再加入200μL Buffer GB 和 200μL的無水乙醇，蓋好蓋子后上下顛倒混勻。

5.混勻后將液體轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的吸附柱中，12000rpm離心2分鐘；棄濾液。

6.向吸附柱中加入500μL Buffer WA，12000rpm離心1分鐘；棄濾液。

7.吸附柱的管壁四周加入700μL Buffer WB ，靜置1分鐘，再12000rpm離心1分鐘；棄濾液；（注意：一定要保證WB中已經(jīng)加過了指定體積的無水乙醇；沿著吸附柱管壁四周加入WB，有助于完全沖洗沾附管壁上的鹽份。）

8.重復(fù)操作步驟7，棄濾液.

9.空甩： 12000rpm 離心2分鐘。

10.將吸附柱放置在一個(gè)新的1.5mL的離心管上，蓋子開著，室溫放置10分鐘，以去除殘留的乙醇；（注意：乙醇?xì)埩魰�抑制聚合酶擴(kuò)增）。

11.向吸附柱膜的中央加入50μL 預(yù)熱過的0.25X TE buffer，蓋好蓋子后室溫靜置10分鐘；（注意：預(yù)熱的滅菌水可以提高洗脫效率）。

12.12000rpm 離心2分鐘洗脫DNA；可以將離下的液體再次加入膜中央，再靜置5分鐘，再12000rpm 離心2分鐘，獲得濃度更高的DNA。

13.將獲得DNA測濃度，也可以通過電泳觀察純度。

 

方法二:

使用粗裂的方法獲得鼠尾基因組DNA（適用于擴(kuò)增＜1kb的條帶）。

 

Triton裂解液的配制：（1L量）

 

1）分別用電子天平稱取下列物品至燒杯：

KCl：3.7g

Tris：1.2g

2）加入300~400mL滅菌水溶解。

3）加入1mL TritonX-100，充分溶解，若不能充分溶解可以放入56℃烘箱中溶解。（TritonX-100呈油狀液體，注意吸取前先潤洗移液器，注意打盡TritonX-100后才能把槍頭伸到溶液中反復(fù)吹吸，否則很容易使得TritonX-100大量殘留在槍頭內(nèi)壁上）。

4）加入80μL濃鹽酸調(diào)pH至9.0。

5）然后用滅菌水定容至1L后，室溫保存，待用。

注意：TritonX-100高壓滅菌后會產(chǎn)生大量沉淀，請勿高壓滅菌。

 

樣品的裂解：

1）取鼠尾或者鼠爪（~2mm）至EP管，加入98μL裂解液+2μL 20mg/mL的蛋白酶K（注：鼠尾不可超過3mm，不然裂解不充分，若鼠尾過粗，可以適量增加裂解液的量；蛋白酶K需要注意不要反復(fù)凍融，不然會影響活性）。

2）加了裂解液和蛋白酶K后，將EP管放入56℃烘箱或者水浴鍋，過夜運(yùn)行；

第二天從烘箱中取出樣品，放置金屬浴或者PCR儀中，98℃反應(yīng)15分鐘，目的是使蛋白酶K失活。

3）之后將樣品離心15分鐘，上清即可作為PCR模板。（一般25μL的PCR體系中，可以加入1.5μL的上清）。

 

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