4月8日凌晨，有一群比跨年還要積極的人在期盼武漢重啟的到來，這是抗擊SARS-CoV-2戰(zhàn)役中最輝煌的一刻，標志著我國疫情得到有效控制并且經濟開始有序復蘇。整整76天，我們迎來了勝利的曙光，但國外的疫情卻愈演愈烈，呈加速擴散蔓延態(tài)勢。為了防止輸入性病例再次傳染，我國各通商口岸以及人流通道均已采取了強有力的措施，可見新冠病毒在對生命構成嚴重威脅的同時也對各國經濟造成了不可挽回的損失。

 

 

一、SARS-CoV-2的來源

通過傳染病及流行病學調查，以及測序分析和比對，我國科學家發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-2最初來源于蝙蝠，但由于蝙蝠與人類的生活環(huán)境相隔甚遠，要讓病毒直接從蝙蝠傳到人身上似乎也沒有那么容易，于是中間宿主就成了科研界需要證實的課題，穿山甲？蛇？龜殼類？雪貂？貓？眾說紛紜。關于貓攜帶病毒并在貓之間進行新冠傳播已經得到實驗證實，但是對于貓是否能夠將新冠病毒直接傳染給人，還需要更進一步的確證。

 

二、 SARS-CoV-2是什么

SARS-CoV-2是冠狀病毒的一個分支，是由四種主要蛋白以及若干輔助蛋白包裹著遺傳物質的正鏈RNA病毒，主要通過S蛋白與宿主細胞受體結合來介導病毒的入侵，決定病毒的組織和宿主嗜性。人類冠狀病毒具有很高的基因組核苷酸取代率和重組能力，被認為是目前發(fā)展最快的病毒之一，而人類冠狀病毒與多種嚴重程度不同的呼吸系統(tǒng)疾病相關，例如感冒、肺炎和支氣管炎。包括此次疫情的罪魁禍首新冠病毒在內，已鑒定出有7種會引起人類呼吸系統(tǒng)疾病的冠狀病毒：hCoV-229E、hCoV-NL63、hCoV-OC43、hCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2。除了呼吸系統(tǒng)外，腸道和神經系統(tǒng)也會受到這些病毒的影響。

 

SARS-CoV-2內部有一個螺旋對稱的核衣殼，包裹著一個大約30kb左右的單鏈正向RNA基因組，在病毒復制周期中具有三種功能：

● 作為感染周期的起始RNA；

● 作為復制和轉錄的模板；

● 作為包裝成子代病毒的底物。

 

三、SARS-CoV-2的的附著和侵入

SARS-CoV-2與SARS-CoV以及hCoV-NL63的主要宿主細胞受體都是血管緊張素轉化酶ACE2，細胞環(huán)境中的低pH值和相關的組織蛋白酶有助于膜融合從而使病毒進入細胞。根據(jù)之前的調研，我們發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白酶TMPRSS2可以裂解病毒S1/S2位點以激活S蛋白，使非蛋白體病毒進入細胞而導致感染；ADAM17可以通過促進ACE2胞外區(qū)的脫落來增強酶活性進而促進病毒與胞質融合；IFITM3通過調節(jié)宿主膜的流動性防止病毒包膜與細胞質膜融合，從而阻止病毒入侵；LY6E是糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的細胞表面蛋白，能夠通過調節(jié)病毒半融合狀態(tài)，也可以通過調節(jié)細胞骨架的重排，來促進病毒融合并侵入細胞；CD209L（L-SIGN）的多肽區(qū)域變體的雜合表達可能會改變病毒與配體的結合能力，而炎性因子同樣在SARS-CoV感染中起作用，增加SARS-CoV的易感性。這些宿主受體分子，是病毒與細胞之間非常好的媒介物，于是聰明的病毒就通過各種有利求生的方式附著并侵入宿主。

 

四、SARS-CoV-2的復制

病毒，是一種介于生命與非生命之間的物質，其本身并沒有生命跡象，必須依賴于宿主細胞才能存活。SARS-CoV-2也是一樣，利用宿主細胞機制進行自身的復制和傳播，它要經歷附著、進入宿主細胞、復制酶-轉錄酶的翻譯、基因組復制、mRNA轉錄以及新病毒的組裝等過程。SARS-CoV-2的感染始于S蛋白RBD結構域與其同源受體的附著，S蛋白中S2亞基構象發(fā)生改變，促進了病毒和細胞膜的融合。核衣殼釋放到細胞質后，病毒基因組RNA（gRNA）通過核糖體移碼翻譯產生多蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab由宿主和病毒蛋白酶進行水解處理，生成16個非結構蛋白（NSP），然后組裝形成復制酶-聚合酶。復制酶聚合酶參與新型冠狀病毒的復制，在該過程中基因組RNA被復制，亞基因組RNA被轉錄和翻譯形成結構蛋白。病毒產物將在高爾基體中組裝，并以光滑壁囊泡的形式出芽到脂膜，通過胞吐作用排出。

 

五、SARS-CoV-2與先天免疫

當細胞暴露于病原體中時，免疫反應防御機制被激活，以細胞依賴性方式調節(jié)免疫應答。先天免疫是抵御病毒的第一道防線。宿主和病毒都可以操縱先天性免疫機制，作為防御或逃避的策略形式。免疫系統(tǒng)通過模式識別受體（PRR）來識別并結合病原體。PRR主要分為三類：

 

1. Toll樣受體（TLR）。TLR的激活主要發(fā)生在抗原呈遞細胞中，例如樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞、單核細胞和B細胞。識別病毒成分以后，TLR募集含有Toll/IL-1受體（TIR）的信號轉接分子，例如髓樣分化初級反應蛋白88（MyD88）和β干擾素TIR結構域銜接蛋白（TRIF），然后MyD88和TRIF刺激MAPK和NF-κB通路，從而增強IFN和促炎因子的產生；

 

2. 視黃酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLR）。RLR是一個胞質受體家族，由三個成員組成，一個是RIG-I，一個是MDA5（melanoma differentiatioin associated factor 5），另一個是LGP2 (laboratory of genetics and physiology 2)。RIG-I識別病毒基因組RNA中的5’三磷酸部分，以及通過病毒基因組互補末端的自我退火形成的雙鏈結構，相反，MDA5通常會檢測到更長的dsRNA序列。RIG-1和MDA5與病毒RNA的結合會導致構象改變，從而暴露出CARD域，募集定位于線粒體和過氧化物酶體的抗病毒信號轉導分子MAVS，MAVS激活轉錄因子，觸發(fā)干擾素IFN和促炎細胞因子的表達；

 

3. 核苷酸寡聚化樣受體（NLR）。NLR是PRR中的另一個大家族，LRR基序檢測病毒PAMP，以誘導結構重排，隨后，MAPK和NF-κB信號通路在內的多種信號通路被激活。同時，炎性小體的組裝也是由NLR家族成員介導的，炎性小體激活炎性相關蛋白酶，誘導IL-1β和IL-18前體裂解為活性形式。冠狀病毒的感染，與IFN合成的抑制有關。病毒調節(jié)I型IFN信號轉導的能力是病毒毒力的重要標志，研究表明，冠狀病毒的結構蛋白，非結構蛋白和輔助蛋白會改變先天免疫反應。

 

六、SARS-CoV-2的研究現(xiàn)狀

從病毒爆發(fā)到現(xiàn)在，已在線發(fā)表了上百篇相關的研究論文，科學家們從不同角度對SARS-CoV-2進行探討，包括病毒的流行病學和傳染性特征、病毒的溯源，病毒的基因組結構、病毒的結構與功能解析、病毒與宿主受體的結合、宿主潛在受體的探究、病毒入侵宿主后的免疫反應特征等等，那么接下來，我們來聊一下研究現(xiàn)狀：

 

1. SARS-CoV-2直接破壞人的脾臟和淋巴結

 

淋巴細胞減少癥是感染SARS-CoV-2患者的共同特征，但是這種消耗的機制尚不清楚。研究表明SARS-CoV-2可以直接感染繼發(fā)性淋巴器官以誘導細胞死亡。免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的受體ACE2在脾臟和LN中CD169+巨噬細胞上表達。免疫熒光證實，SARS-CoV-2感染會引起嚴重的組織損傷，包括淋巴濾泡耗竭、脾結節(jié)萎縮、組織細胞增生和淋巴細胞減少。病毒感染導致嚴重的淋巴細胞凋亡，可觸發(fā)巨噬細胞產生IL-6，一種直接促進淋巴細胞壞死的促炎因子。因此可以說，SARS-CoV-2通過感染組織直接影響人的脾臟和淋巴。

 

2. SARS-CoV-2 sarbecev亞屬的進化起源導致了新型肺炎COVID-19大流行

 

美國賓夕法尼亞州州立大學生物系傳染病動力學中心研究了COVID-19進化問題：

● 新病毒與SARS的相關性；

● 蝙蝠作為自然病毒庫所起的作用；

● 其他哺乳動物的潛在感染性；

● 重組在病毒出現(xiàn)中的作用。

作者發(fā)現(xiàn)sarbecoviruses（SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒都是這個亞屬），出現(xiàn)頻繁的重組，但是在SARS-CoV-2譜系本身并沒有檢測到病毒的重組體。

 

研究表明，蝙蝠中存在一種單一的血統(tǒng)，其特征使其能夠感染人類細胞，如先前針對于第一個SARS-CoV血統(tǒng)相關的蝙蝠sarbecoviruses所述。為了評估該血統(tǒng)在蝙蝠中傳播的時間長短，研究者估計了進化到SARS-CoV-2和RaTG13的最近共同祖先tMRCA的時間。用三種生物信息學方法來消除重組的影響，并且結合使用這些方法來確定推定的非重組區(qū)域，這些區(qū)域可用于可靠的系統(tǒng)發(fā)育重建和年代測定。雖然穿山甲可能是促進病毒向人類傳播的中間物種，但證據(jù)表明，該病毒與蝙蝠中進化產生的蝙蝠sarbecovirus一致，他們可以在人和穿山甲的上呼吸道中復制。

 

3. SARS-CoV-2的核衣殼蛋白（nCoVN）消除了人誘導多能干細胞（iPSC）的多能性

 

nCoVN破壞了iPSC的多能性并將其轉變?yōu)槌衫w維細胞。逆轉錄PCR（RT-RCR）結果表明ACE2在iPSC，iPSC衍生的心肌細胞（iPSC CM）和人冠狀動脈內皮細胞（HCAEC）表達，表明這些細胞是SARS-CoV-2的潛在目標。同時，nCoVN可能損害生殖系統(tǒng)和造血系統(tǒng)。

 

4. SARS-CoV-2受體識別的結構基礎

 

近期的研究探索了hACE2結合SARS-CoV-2受體結構域RBD的晶體結構。與SARS-CoV RBD相比，SARS-CoV-2 RBD中的hACE2中的一些殘基變化穩(wěn)定了RBD/hACE2界面上的兩個病毒結合熱點。SARS-CoV-2 RBD的這些結構特征增強了其與hACE2結合親和力。此外，作者還顯示RaTG13，一種與SARS-CoV-2密切相關的蝙蝠冠狀病毒，也使用hACE2作為其受體。hACE2識別SARS-CoV-2、SARS-CoV和RaTG13之間的差異揭示了SARS-CoV-2在動物和人類之間潛在的傳播形式。

 

很多研究表明病毒表面刺突蛋白介導冠狀病毒進入宿主細胞，近期的研究闡明了SARS-CoV-2受體識別的結構和生化機制。SARS-CoV棘突蛋白包含一個受體結合域RBD，RBD特異性識別ACE2，研究者之前確定了來自不同宿主的ACE2結合不同毒株的SARS-CoV RBD的一系列晶體結構，表明SARS-CoV RBD含有一個核心和一個受體結合基序（RBM），RBM介導與ACE2的相互作用。hACE2的表面包含兩個病毒結合熱點，這對于SARS-CoV結合至關重要。

 

5. 動物模型在SARS-CoV-2病毒性疾病中的應用

 

對冠狀病毒本身以及宿主受體的基出研究，我們已經取得了很多進展，但對于疫苗的開發(fā)和抗病毒藥物的研制依然沒有達到理想的狀態(tài)，隨著科學技術的發(fā)展，疫苗開發(fā)的方式變得多樣化，為我們快速得到有效疫苗爭取了時間，同時抗病毒藥物的全新開發(fā)以及舊藥新用，都必須落實到動物水平進行驗證。而由于物種間的差異，目前SARS-CoV-2宿主受體蛋白ACE2在各物種之間并不相同，其結合病毒的基序也并不完全一致，研究表明ACE2在貓和人類之間存在差異，在小鼠和人類之間同樣存在差異，事實是人源ACE2的hotspot31與hotspot353氨基酸為賴氨酸，而鼠源ACE2卻多了一個組氨酸，組氨酸的存在阻礙了病毒與ACE2的結合，也就是說這種差異對病毒入侵是不利的，同樣，MEAR-CoV受體靶點DPP4中兩個關鍵氨基酸A288和T330在人和小鼠中是不一樣的，因此我們在應用小鼠模型時就必須考慮利用現(xiàn)在的基因編輯技術將受體基因進行人源化，最大限度模擬冠狀病毒感染人類的動物模型，然而制備易感動物模型也不是短期內就能夠立馬實現(xiàn)的事情，而且主要受體也并不是病毒作用的單一方式，也會受到各種酶分子或者免疫調節(jié)分子的制約，對于各種潛在影響SARS-CoV-2感染人類的各種相關因素我們仍知之甚少，根據(jù)各項調研結果，我們發(fā)現(xiàn)針對冠狀病毒的研究，潛在靶基因TMPRSS2、ADAM17、CD209L、CD147、AGO4等的功能不能忽略，這些分子不管是從幫助病毒本身入侵機體還是參與病毒與ACE2的結合，均會影響到病毒感染人并發(fā)病的生物學過程，而APN、DPP4作為冠狀病毒的人類受體，同樣具有重要的研究意義。因此，人源化小鼠模型是冠狀病毒的研究中必不可少的重要工具。

 

作為一家專業(yè)的有責任感的模式動物服務商，賽業(yè)生物自疫情爆發(fā)以來便緊急召集公司的研發(fā)人員全力研發(fā)與新型冠狀病毒研究相關的動物模型。目前公司用于新冠肺炎研究、疫苗研發(fā)或者新藥篩選的動物模型研發(fā)正加快推進，同步開展ACE2、DPP4和APN三種冠狀病毒關鍵受體的C57和BALB/c背景品系的人源化模型、基因敲除模型和ROSA26基因敲入小鼠模型。為了能用專業(yè)特長為疫情防治貢獻一份力量，賽業(yè)生物一方面將加快上述三種冠狀病毒關鍵受體基因改造的“基因鼠”和其它更多冠狀病毒靶點相關的動物模型的研發(fā)，同時啟動針對參與湖北省新冠疫情救援的一線科研人員的公益項目，免費捐贈ACE2基因敲除小鼠、ACE2人源化小鼠和ACE2條件性基因敲入小鼠等新冠肺炎病毒研究相關受體小鼠模型，助力防疫攻堅。

 

對于新型冠狀病毒的研究，我們還有很長的路要走，如何尋找出路，無非是找到最合適的疫苗，將病毒消滅在萌芽狀態(tài)，亦或者制備合適的抗病毒藥物，將病毒扼殺在繁殖過程中，了解它，才能戰(zhàn)勝它。對于冠狀病毒，我想最終它的目的并不是消滅人類，而是與人類和諧相處，但是，它的危害如何？我們人類對它的控制能力如何？有多少把握能夠將它掌控在我們的技術范圍中？這些都是必須解決的問題。

 

課程預告

 

本期課程劉璐博士將為大家解析冠狀病毒感染宿主受體熱門靶點，下期課程俞曉峰博士將為大家講解如何選擇合適的小鼠模型研究冠狀病毒。參與課程互動還有機會抽中以下精美禮品一份：小米手環(huán)或華為耳機，快來報名參加課程吧～

 

 

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參考文獻：

1. Yvonne Xinyi Lim, Yan Ling Ng, James P. Tam and Ding Xiang Liu. Human Coronaviruses: A Review of Virus–Host Interactions. Disease. 2016.

2. Zeqing Feng, Bo Diao, Rongshuai Wang et al. SARS-CoV-2 infects human splees and lymph nodes. medRxiv preprint. 2020.

3. Maciej F Boni, Philippe Lemey, Xiaowei Jiang et al. Evolutionary origins of the SARS-CoV-2 sarbecovirus lineage responsible for the COVID-19 pandemic. BioRxiv preprint. 2020.

4. Lin Zebin, Gao Qiang, Fang Qian et al. The nucleocapsid protein of SARS-CoV-2 abolished pluripotency in human induced pluripotent stem cells. BioRxiv preprint. 2020.

5. JianShang, Gang Ye, Ke Shi et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 2020.