PROTAC技術的小分子降解劑類型概況
近年來，PROTAC技術以其可靶向傳統(tǒng)“不可成藥”蛋白的獨特優(yōu)勢而備受醫(yī)藥研發(fā)人員的關注。目前對PROTACs技術的突破主要集中在對于E3連接酶類型的改變，使PROTACs由肽類向小分子轉變。泛素連接酶E3是一個蛋白家族，泛素化修飾的失調會給生命體帶來一系列負面影響,嚴重者將導致疾病,甚至危及生命，泛素連接酶E3是泛素化修飾反應中底物特異性的直接決定者,其機制研究不僅可揭示蛋白質質量控制和生命活動功能的奧秘,也將為疾病關聯(lián)失調蛋白的精準調控和精準醫(yī)學實踐提供技術支撐。
PROTAC技術可以將小分子抑制劑與E3 泛素連接酶的配體通過連接鏈進行連接,形成一種靶向誘導蛋白降解聯(lián)合體。在生物體內, PROTAC技術的小分子抑制劑部分可以識別靶白,E3 的配體部分可以識別E3 泛素連接酶,從而將靶蛋白與E3 泛素連接酶拉近,使E2 泛素結合酶上的泛素轉移至靶蛋白上,將目標蛋白泛素化,然后通過泛素-蛋白酶體途徑使底物蛋白降解。
為了拓展PROTAC技術在藥物研發(fā)中的應用范圍,尋找E3 泛素連接酶的小分子配體是一個重要的突破口。今天我們來盤點一下，文獻中報道的E3 泛素連接酶的配體有哪些？
1、MDM2
鼠雙微體(murine double minute，MDM)家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，尤其是在p53的調節(jié)中發(fā)揮重要作用。MDM家族中MDM2以及與其相似的MDMX研究較多，2008年，第一個完整意義上的小分子PROTACs出現(xiàn)。有研究者報道了E3 泛素連接酶(MDM2)的配體nutlin 與雄激素受體抑制劑連接的PROTAC,可以觀察到雄激素受體的部分降解。
MDM2及MDMX原癌基因蛋白能夠抑制p53、p73，可能還有p63。MDM2和MDMX能夠影響p53靶基因的特異性，改變其他轉錄因子的活性，同時MDM2本身可通過染色質翻譯后修飾，轉變?yōu)檗D錄協(xié)同因子。MDM2蛋白含有數(shù)個功能結構域，這些結構域為MDM2的致瘤特性提供結構上的支持，尤其是N7端p53連接域在與腫瘤抑制蛋白p53的連接及抑制p53轉錄活性中起重要作用。此外，其c’端的環(huán)指結構域與MDM2的E3泛素連接酶的活性相關，能夠招募泛素結合酶E2，從而促進泛素化、降解目的蛋白。
泛素化和降解p53是MDM2負性調節(jié)p53的主要途徑，因此MDM2的泛素連接酶活性可作為p53活化的一個靶點。在腫瘤細胞中，特異性針對MDM2的泛素連接酶活性的小分子抑制劑能夠激活p53信號通路、誘導p53依賴的細胞凋亡。
藥物化學研究的最終目的是發(fā)現(xiàn)新的藥物分子，美迪西藥物化學部建立了PROTAC藥物發(fā)現(xiàn)技術平臺，匯總了當前流行的熱門的靶標蛋白配體, 建立廣泛的熱門靶向蛋白高度親和力小分子及小分子片段化合物庫（TPSM），廣泛的E3連接酶高度親和力的小分子及小分子片段（E3SM），建立了linker系統(tǒng),包括收集了大量具有廣泛多樣性的雙官能團連接體（BF-Linker）。
2、cIAP
IAP E3家族蛋白都含有一個或幾個BIR結構域，能夠抑制凋亡。2010年，Hashimoto等使用烏苯美司酯(Bestatin eaters，MeBS)與全反式維甲酸(ATRA)結合，設計了基于cIAPl E3的PROTACs。抑癌基因失活和細胞凋亡紊亂參與了細胞的惡性轉化以及腫瘤的進展在腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)督過程中發(fā)揮著至關重要的作用，且與腫瘤耐受放化療以及術后復發(fā)均存在密切關系。凋亡抑制蛋白(clAP) 屬于凋亡抑制因子家族成員之一，其可通過抑制半朧氨酸天冬氨酸蛋白酶7( Caspase-7 )以及Caspase-9 等的活性，進一步達到抑制細胞凋亡的目的。
3、VHL
VHL 最經典的功能是作為ECV(Elongin B/C,Cullen-2,VHL)E3 泛素連接酶復合物的底物識別亞基促進HIF-α的降解。研究者Crews等設計并改造了E3 泛素連接酶(VHL)的配體,發(fā)現(xiàn)了具有高親和力的VHL 配體。利用這類VHL 小分子配體,Crews 等報道了雌激素相關受體α(ERRα)和RIPK2 的PROTAC 分子(PROTAC_ERRα 和PROTAC RIPK2),均能在細胞水平觀察到相應靶蛋白的降解。其中,PROTAC RIPK2 的濃度為10 nM 時,靶蛋白基本完全降解,并具有較高的選擇性。
4、CRBN
2015 年,Bradner 課題組和Crews 課題組分別報道了利用E3 泛素連接酶(CRBN)的配體(度胺類藥物)與BRD4 的抑制劑JQ1,設計雙功能分子dBET1 和ARV-825 的方法。羥腦苷脂(CRBN)是一種具有離子蛋白酶活性的大腦相關蛋白，CRBN與DDBl、Cul4、RoCl相互作用形成功能性CRBN—CRL4，該復合體通過調節(jié)DNA修復、復制和轉錄作用參與細胞周期調節(jié)、胚胎發(fā)育和癌變。在該復合物中，CRBN作為CRBN—CRL4的底物受體，結合底物后使底物蛋白通過泛素一蛋白酶體途徑進行蛋白水解。
雖然目前PROTAC技術已經發(fā)展迅速，但是在應用過程中面臨著E3泛素連接酶的配體較少的挑戰(zhàn)。因此尋找“不可成藥”蛋白質的合適配體、發(fā)現(xiàn)更多的E3連接酶類型是擴大PROTACs應用領域的必由之路。
PROTAC技術可以將小分子抑制劑與E3 泛素連接酶的配體通過連接鏈進行連接,形成一種靶向誘導蛋白降解聯(lián)合體。在生物體內, PROTAC技術的小分子抑制劑部分可以識別靶白,E3 的配體部分可以識別E3 泛素連接酶,從而將靶蛋白與E3 泛素連接酶拉近,使E2 泛素結合酶上的泛素轉移至靶蛋白上,將目標蛋白泛素化,然后通過泛素-蛋白酶體途徑使底物蛋白降解。
為了拓展PROTAC技術在藥物研發(fā)中的應用范圍,尋找E3 泛素連接酶的小分子配體是一個重要的突破口。今天我們來盤點一下，文獻中報道的E3 泛素連接酶的配體有哪些？
1、MDM2
鼠雙微體(murine double minute，MDM)家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，尤其是在p53的調節(jié)中發(fā)揮重要作用。MDM家族中MDM2以及與其相似的MDMX研究較多，2008年，第一個完整意義上的小分子PROTACs出現(xiàn)。有研究者報道了E3 泛素連接酶(MDM2)的配體nutlin 與雄激素受體抑制劑連接的PROTAC,可以觀察到雄激素受體的部分降解。
MDM2及MDMX原癌基因蛋白能夠抑制p53、p73，可能還有p63。MDM2和MDMX能夠影響p53靶基因的特異性，改變其他轉錄因子的活性，同時MDM2本身可通過染色質翻譯后修飾，轉變?yōu)檗D錄協(xié)同因子。MDM2蛋白含有數(shù)個功能結構域，這些結構域為MDM2的致瘤特性提供結構上的支持，尤其是N7端p53連接域在與腫瘤抑制蛋白p53的連接及抑制p53轉錄活性中起重要作用。此外，其c’端的環(huán)指結構域與MDM2的E3泛素連接酶的活性相關，能夠招募泛素結合酶E2，從而促進泛素化、降解目的蛋白。
泛素化和降解p53是MDM2負性調節(jié)p53的主要途徑，因此MDM2的泛素連接酶活性可作為p53活化的一個靶點。在腫瘤細胞中，特異性針對MDM2的泛素連接酶活性的小分子抑制劑能夠激活p53信號通路、誘導p53依賴的細胞凋亡。
藥物化學研究的最終目的是發(fā)現(xiàn)新的藥物分子，美迪西藥物化學部建立了PROTAC藥物發(fā)現(xiàn)技術平臺，匯總了當前流行的熱門的靶標蛋白配體, 建立廣泛的熱門靶向蛋白高度親和力小分子及小分子片段化合物庫（TPSM），廣泛的E3連接酶高度親和力的小分子及小分子片段（E3SM），建立了linker系統(tǒng),包括收集了大量具有廣泛多樣性的雙官能團連接體（BF-Linker）。
2、cIAP
IAP E3家族蛋白都含有一個或幾個BIR結構域，能夠抑制凋亡。2010年，Hashimoto等使用烏苯美司酯(Bestatin eaters，MeBS)與全反式維甲酸(ATRA)結合，設計了基于cIAPl E3的PROTACs。抑癌基因失活和細胞凋亡紊亂參與了細胞的惡性轉化以及腫瘤的進展在腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)督過程中發(fā)揮著至關重要的作用，且與腫瘤耐受放化療以及術后復發(fā)均存在密切關系。凋亡抑制蛋白(clAP) 屬于凋亡抑制因子家族成員之一，其可通過抑制半朧氨酸天冬氨酸蛋白酶7( Caspase-7 )以及Caspase-9 等的活性，進一步達到抑制細胞凋亡的目的。
3、VHL
VHL 最經典的功能是作為ECV(Elongin B/C,Cullen-2,VHL)E3 泛素連接酶復合物的底物識別亞基促進HIF-α的降解。研究者Crews等設計并改造了E3 泛素連接酶(VHL)的配體,發(fā)現(xiàn)了具有高親和力的VHL 配體。利用這類VHL 小分子配體,Crews 等報道了雌激素相關受體α(ERRα)和RIPK2 的PROTAC 分子(PROTAC_ERRα 和PROTAC RIPK2),均能在細胞水平觀察到相應靶蛋白的降解。其中,PROTAC RIPK2 的濃度為10 nM 時,靶蛋白基本完全降解,并具有較高的選擇性。
4、CRBN
2015 年,Bradner 課題組和Crews 課題組分別報道了利用E3 泛素連接酶(CRBN)的配體(度胺類藥物)與BRD4 的抑制劑JQ1,設計雙功能分子dBET1 和ARV-825 的方法。羥腦苷脂(CRBN)是一種具有離子蛋白酶活性的大腦相關蛋白，CRBN與DDBl、Cul4、RoCl相互作用形成功能性CRBN—CRL4，該復合體通過調節(jié)DNA修復、復制和轉錄作用參與細胞周期調節(jié)、胚胎發(fā)育和癌變。在該復合物中，CRBN作為CRBN—CRL4的底物受體，結合底物后使底物蛋白通過泛素一蛋白酶體途徑進行蛋白水解。
雖然目前PROTAC技術已經發(fā)展迅速，但是在應用過程中面臨著E3泛素連接酶的配體較少的挑戰(zhàn)。因此尋找“不可成藥”蛋白質的合適配體、發(fā)現(xiàn)更多的E3連接酶類型是擴大PROTACs應用領域的必由之路。
