研究過蛋白的人都能深刻體會其復(fù)雜性和多功能性，為解決蛋白研究的困境，應(yīng)運(yùn)而生了一系列技術(shù)、方法、儀器等。質(zhì)譜技術(shù)就是其中一個典型代表，常被用于幾個蛋白研究的重要方向：蛋白基礎(chǔ)功能探究（結(jié)構(gòu)、相互作用核酸/蛋白/蛋白組、修飾功能等），蛋白鑒定（定位、機(jī)理等），蛋白定量等。

 

很多初入門者一般談“譜”色變，不僅因為機(jī)器技術(shù)門檻高，而且對于上機(jī)樣品的質(zhì)量要求極高。質(zhì)譜儀性能的迭代更新為我們提供了更高的精度、更快的速度、更多的鑒定效率，而建立成熟完善的樣品前處理方法才是最重要的環(huán)節(jié)。

 

依據(jù)蛋白樣本的來源種類，質(zhì)譜樣品一般分為細(xì)胞、組織、體液（血清、血漿、腦脊液、尿液等）。

 

圖1. 基于質(zhì)譜的定量蛋白組工作流程

 

以下為大家整理了質(zhì)譜上機(jī)前蛋白樣品制備的幾個核心環(huán)節(jié)和解決方案👇。

 

1 蛋白提取

 

1. 細(xì)胞或組織樣品裂解

細(xì)胞裂解及高效地蛋白提取對于高質(zhì)量的蛋白純化至關(guān)重要。以下提供針對細(xì)菌、哺乳動物、酵母和植物細(xì)胞的裂解方案，以取得較之傳統(tǒng)物理裂解法更高的蛋白得率，甚至可從細(xì)胞樣品中選擇性提取目的蛋白及總蛋白的、亞組分蛋白，以及線粒體、葉綠體、細(xì)胞核、高爾基體及溶酶體等重要的細(xì)胞器。這些產(chǎn)品可與大多數(shù)親和純化方法相兼容，并且可以最大程度的保留蛋白活性，以備下游分析之用。

 

表1. 重組蛋白提取相關(guān)產(chǎn)品👇

表2. 天然蛋白提取相關(guān)產(chǎn)品👇

 

蛋白抽提過程中為防止蛋白降解，及時對蛋白酶進(jìn)行抑制是很有必要的，比如MSSAFE系列質(zhì)譜專用蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物，成功避免了任何抑制劑成分帶來的對蛋白的修飾，且不含金屬螯合劑，與IMAC兼容。

 

2. 體液樣本預(yù)處理

體液樣本在biomarker的發(fā)現(xiàn)中有重要意義，雖然目前還沒有通過質(zhì)譜篩選或鑒定的方法發(fā)現(xiàn)的biomarker，但科學(xué)家們正在嘗試改良低豐度蛋白的富集和鑒定效率。這就需要我們能高效地去除體液樣本中的高豐度蛋白，如Albumin，IgG，transferrin等。相比市面上只能去除2種、12種的高豐度蛋白試劑，Seppro系列可去除多達(dá)50多種的中高豐度蛋白，富集到占總蛋白1%的低豐度蛋白。除了人類體液樣本Seppro^® 還有試劑盒用于小鼠和大鼠樣品的處理，以及從植物樣品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。
 

 

圖2.人血漿蛋白組中高豐度蛋白分布圖

 

表3. 高豐度蛋白去除相關(guān)產(chǎn)品👇

 

2 蛋白定量

 

蛋白質(zhì)種類繁多且結(jié)構(gòu)不均一，分子量相差也很大，功能各異。生物實驗室中蛋白定量以Bradford法（B6916 Bradford Reagent）、BCA法（71285 BCA Protein Assay Kit）、考馬斯亮藍(lán)染色法最為常用。

 

3 蛋白酶解

 

從蛋白到多肽的消化步驟對于酶的要求極高，蛋白質(zhì)組級別的胰蛋白酶保障了出色的序列覆蓋度，同時消除了模糊的自溶性MALDI 峰。Trypsin Profile IGD kit 可實現(xiàn)從PAGE 直接到MALDI 的進(jìn)行快速高效完善的消化過程。Protease Profiler 提供了4 種經(jīng)驗證的蛋白酶，可代替胰蛋白酶，進(jìn)行MS 前的蛋白質(zhì)消化步驟。

 

表4. 質(zhì)譜級蛋白酶解相關(guān)產(chǎn)品👇

 

4 蛋白標(biāo)記

 

發(fā)現(xiàn)蛋白組學(xué)（Discovery proteomics）中既可以用label-free的方式，也可以用基于iTRAQ，TMT，SILAC等標(biāo)記方法的分析。例如以下iTRAQ試劑。

 

表5. 推薦的iTRAQ試劑👇

 

5 肽段富集

 

對消化后或標(biāo)記后的多肽進(jìn)行有目的性富集，比如糖肽（高甘露糖型、雜糖、復(fù)合型糖基化肽）、磷酸化多肽、胍基化、泛素化蛋白，可以用于后續(xù)更有針對性的分析。

 

表6. 肽段富集相關(guān)產(chǎn)品👇

 

質(zhì)譜儀一般懼怕樣品中含鹽，所以對肽段脫鹽非常有必要，但樣本珍貴，需要保證高回收率且快速高效進(jìn)行分析物的吸附/洗脫，且后續(xù)能直接用與質(zhì)譜、HPLC、毛細(xì)電泳分析。如以下Supel-Tips和ZipTip系列。

 

表7. 脫鹽相關(guān)產(chǎn)品👇

如果樣本體積較大需進(jìn)行濃縮，則需要選擇對蛋白吸附損失最低、回收效率最高的材料，比如以下Amicon系列濃縮管、超濾管。

圖3. 濃縮、超濾及透析相關(guān)產(chǎn)品

 

6 上機(jī)鑒定

 

完成以上核心步驟后，還需要對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器校準(zhǔn)一直以來依賴廠家工程師，但低效和費時，所以找到靈活簡便的校準(zhǔn)方法可大大提高效率。ProteoMass MALDI校準(zhǔn)試劑盒是業(yè)界廣泛認(rèn)可的高品質(zhì)校準(zhǔn)產(chǎn)品，專門為MALDI-MS 應(yīng)用開發(fā)，經(jīng)過嚴(yán)格測試，不含鹽和金屬離子，改善目的分子的電離效率，同時避免產(chǎn)生導(dǎo)致光譜模糊的加合物。

 

對于定量蛋白組學(xué)，很重要的一點是要選擇標(biāo)準(zhǔn)品。默克可為您提供通用蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白質(zhì)組學(xué)差異動態(tài)范圍標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)譜研究的參照標(biāo)準(zhǔn)品。這兩組標(biāo)準(zhǔn)品均包含相同的48種人類蛋白，分子量在6,000至83,000道爾頓之間。其中的每個組份蛋白都經(jīng)過HPLC純化及AAA定量。

 

表8. 質(zhì)譜校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)產(chǎn)品👇

 

綜上，Mass spec中樣本制備是蛋白組學(xué)分析的最關(guān)鍵步驟，樣品抽提和制備的質(zhì)量和可重復(fù)性直接顯著影響到下游質(zhì)譜的分離和鑒定能力。

 

圖4. 基于樣品類型的樣本制備方法小結(jié)